Bedömning av förändringar Nedsatt Metabola Under Progressiv koloniseringen av bakteriefri mus med 1 H NMR-spektroskopi

Summary

En progressiv kolonisering förfarande beskrivs att ytterligare utvärdera dess effekter på värden levermetabolism. Colonization övervakas icke invasivt genom att utvärdera urinutsöndringen av mikrobiell samarbete metaboliter med hjälp av NMR-baserade metabolisk profilering medan levermetabolismen bedöms av tröjan Magiska Angle Spinning (HR MAS) NMR profilering av intakt biopsi.

Abstract

Det är väl känt att tarmbakterier bidra avsevärt till värden homeostas, vilket ger en rad fördelar såsom immun skydd och vitamin syntes. De levererar också värd en ansenlig mängd näringsämnen, vilket gör detta ekosystem en viktig metabolisk orgel. I samband med allt fler bevis om kopplingen mellan tarmfloran och det metabola syndromet, förstå den metaboliska interaktionen mellan värden och dess tarmfloran blir en viktig utmaning i modern biologi. ^1-4

Colonization (även kallad normaliseringsprocess) betecknar inrättandet av mikroorganismer i en tidigare bakteriefri djur. Även om det är en naturlig process som uppstår vid födseln, är det också ges till vuxna bakteriefri djur för att kontrollera tarmen blommor ekosystemet och ytterligare bestämma dess påverkan på värden ämnesomsättningen. Ett gemensamt förfarande för att kontrollera kolonisationen processen är att använda sondmatning metod med en single eller en blandning av mikroorganismer. Metoden ger en mycket snabb kolonisering och presenterar nackdelen med att vara extremt stressande ^5. Det är därför lämpligt att minimera stress och att få en långsammare kolonisering process för att följa successivt effekterna av bakteriell etablering på värden ämnesomsättningen.

I detta manuskript, beskriver vi ett förfarande för bedömning ändring av levermetabolismen under en successiv kolonisering process med hjälp av ett icke-förstörande tekniken metabolisk profilering. Vi föreslår att övervaka kolonisering tarmen mikrobiella genom att bedöma i tarmen aktivitet mikrobiell metabolism återspeglas i urinutsöndringen av mikrobiell samarbete metaboliter med ¹ H NMR-baserade metabolisk profilering. Detta möjliggör en uppskattning av stabiliteten i tarmen mikrobiell aktivitet utanför stallet inrättandet av tarmen mikrobiella ekosystem vanligtvis kontrolleras genom avföringen bakterier genom DGGE (denaturering elektrofores gradient gel). ⁶kolonisering sker i en konventionell öppen miljö och inleds med en smutsig kull som förorenats med konventionella djur, som fungerar som kontroller. Gnagare är coprophagous djur, säkerställer detta en homogen kolonisering som tidigare beskrivits. ⁷

Nedsatt metabolisk profil mäts direkt från en intakt leverbiopsi med ^ett H Hög Vinkel upplösning Magiska Spinning NMR-spektroskopi. Detta semikvantitativ tekniken erbjuder ett snabbt sätt att bedöma, utan att skada cellstruktur, huvudmetaboliterna som triglycerider, glukos och glykogen för att ytterligare uppskatta det komplexa samspelet mellan kolonisation processen och levermetabolismen ^7-10. Denna metod kan också tillämpas på alla vävnad biopsi ^11,12.

Protocol

1. Kolonisering av bakterie-fria djur och provtagning Ta bort bakteriefri djur från isolatorer och hus dem i en konventionell djurhållning rum i burar utrustade med filter framför den konventionella djur som kommer att fungera som kontroller (Figur 1). Blanda hälften av kullen (3 dagar gamla) som tagits från kontroll konventionella bur med strö av grodden-fria djur. Håll alltid 1 / 3 av det smutsiga konventionella kullen varje gång det är nödvändigt att förnya för att upprätthålla en …

Discussion

I detta protokoll, beskrev vi en progressiv kolonisering förfarande i en öppen miljö för att ytterligare undersöka effekten av tarmfloran om levermetabolism bedömas av ^en H HR-MAS NMR profilering av intakt biopsi. Olika metoder för kolonisering har beskrivits i litteraturen. De vanligaste metoderna för att kolonisera djur med ett definierat mikrobiota är oral sondmatning eller förorenat dricksvatten ^19,20. Fekal inokulationen kan också användas som tidigare beskrivits ^21. Kol…

Materials

Table of specific reagents and equipment:

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
2.5 mm microtube	New Era	NE-H5/2.5-V-Br
1.7 mm capillary tube	Sigma-Aldrich	NORS175001
Capillary adapter	New Era	NE-325-5/1.7
Extraction rod	New Era	NE-341-5
HR-MAS rotor BL4 with 50 μL spherical Teflon spacer kit	Bruker	HZ07213
Tool kit for 50 μL inserts	Bruker	B2950
Advance III 600 MHz NMR	Bruker
1H HR MAS NMR solid probe	Bruker
Deuterium oxide 99.9 %	Sigma-Aldrich	530867-1L
3-(trimethylsilyl)propionic acid-d4 (TSP)	Sigma-Aldrich	269913