CYP2D6 पशु मॉडल: कैसे चूहे में Autoimmune हेपेटाइटिस प्रेरित

Summary

एक Adenovirus व्यक्त प्रमुख मानव स्वप्रतिजन के साथ चूहों के संक्रमण P450 (hCYP2D6) 2D6 व्यापक हैपेटाइटिस, और CYP2D6 एक तंतुमयता पीढ़ी द्वारा विशेषता autoimmune की मध्यस्थता जिगर की बीमारी के एक सतत रूप में टाइप 2 autoimmune हैपेटाइटिस परिणाम से पीड़ित रोगियों के सीरा द्वारा मान्यता प्राप्त साइटोक्रोम विशिष्ट प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया है.

Abstract

Autoimmune hepatitis is a rare but life threatening autoimmune disease of the liver of unknown etiology^1,2. In the past many attempts have been made to generate an animal model that reflects the characteristics of the human disease ^3-5. However, in various models the induction of disease was rather complex and often hepatitis was only transient^3-5. Therefore, we have developed a straightforward mouse model that uses the major human autoantigen in type 2 autoimmune hepatitis (AIH-2), namely hCYP2D6, as a trigger⁶. Type 1 liver-kidney microsomal antibodies (LKM-1) antibodies recognizing hCYP2D6 are the hallmark of AIH-2^7,8. Delivery of hCYP2D6 into wildtype FVB or C57BL/6 mice was by an Adenovirus construct (Ad-2D6) that ensures a direct delivery of the triggering antigen to the liver. Thus, the ensuing local inflammation generates a fertile field⁹ for the subsequent development of autoimmunity. A combination of intravenous and intraperitoneal injection of Ad-2D6 is the most effective route to induce a long-lasting autoimmune damage to the liver (section 1). Here we provide a detailed protocol on how autoimmune liver disease is induced in the CYP2D6 model and how the different aspects of liver damage can be assessed. First, the serum levels of markers indicating hepatocyte destruction, such as aminotransferases, as well as the titers of hCYP2D6 antibodies are determined by sampling blood retroorbitaly (section 2). Second, the hCYP2D6-specific T cell response is characterized by collecting lymphocytes from the spleen and the liver. In order to obtain pure liver lymphocytes, the livers are perfused by PBS via the portal vein (section 3), digested in collagen and purified over a Percoll gradient (section 4). The frequency of hCYP2D6-specific T cells is analyzed by stimulation with hCYP2D6 peptides and identification of IFNγ-producing cells by flow cytometry (section 5). Third, cellular infiltration and fibrosis is determined by immunohistochemistry of liver sections (section 6). Such analysis regimen has to be conducted at several times after initiation of the disease in order to prove the chronic nature of the model. The magnitude of the immune response characterized by the frequency and activity of hCYP2D6-specific T and/or B cells and the degree of the liver damage and fibrosis have to be assessed for a subsequent evaluation of possible treatments to prevent, delay or abrogate the autodestructive process of the liver.

Protocol

1. नेत्र साइनस में विज्ञापन 2D6 की नसों में इंजेक्शन बाँझ शर्तों के तहत, विज्ञापन 2D6 वायरस शेयर 5 के एक एकाग्रता के लिए समाधान पतला x 9 10 / pfu में मिलीलीटर RPMI और बर्फ पर वायरस विज्ञापन 2D6 समाधान रखना. 5 x 10 8 pfu (नसों और intraperitoneal) की दो खुराक इंजेक्शन FVB तनाव के चूहों में autoimmune हैपेटाइटिस के सबसे विश्वसनीय परिणाम में परिणाम साबित कर दी है. 4 एक संज्ञाहरण कक्ष में isoflurane% के साथ माउस असंवेदनता उत्पन्न करना. हिंद पैर चुटकी यकीन है कि पशु anesthetized है. गर्दन के पीछे से पकड़ माउस और अंगूठे और मध्यम उंगली के साथ सिर की ढीली त्वचा कस. इस तरह, आँख आँख करने के लिए आसन्न त्वचा के लिए कर्षण के द्वारा थोड़ा protrudes. सुई औसत दर्जे का नेत्रकोण (पशु नाक के करीब पलकें जंक्शन) में खड़ी प्लेस और धीरे धीरे 100 μl वायरस विज्ञापन 2D6 समाधान इंजेक्षन. यह महत्वपूर्ण है के लिए बहुत अधिक दबाव लागू नहीं करने के लिएवाहिकाओं और ट्रेकिआ के नुकसान से बचने. सुई धीरे धीरे वापस लेने के लिए spillage से बचने के लिए और पलकें बंद. इंजेक्शन अच्छी तरह से काम किया है अगर वायरस समाधान बाहर नहीं गर्त नाक रिसाव होता है, और आँख अपनी प्रारंभिक स्थिति में वापस स्लाइड. तुरंत अंतःशिरा इंजेक्शन के बाद, विज्ञापन 2D6 वायरस समाधान के दूसरे 100 μl की एक मानक intraperitoneal इंजेक्शन प्रदर्शन. वैकल्पिक रूप से, अंतःशिरा इंजेक्शन पूंछ नस के माध्यम से क्रियान्वित किया जा सकता है. हालांकि, नेत्र साइनस के माध्यम से इंजेक्शन बहुत आसान है के लिए प्रदर्शन और वायरस के समाधान के नुकसान कम से कम. यह दिखा दिया है कि इन दो तकनीकों interchangeably और दोनों मार्गों समान रूप से 10 प्रभावी रहे हैं कि इस्तेमाल किया जा सकता है. संक्रमित चूहों प्रतिकूल प्रभाव और पीड़ा और दर्द की भूख न लगना, वजन में कमी, गतिशीलता की कमी, दूल्हे को विफलता, किसी न किसी बाल कोट के रूप में स्पष्ट संकेत के लिए निगरानी कर रहे हैं, hunchedउपस्थिति, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से चाट, काटने, scratching, या एक विशेष क्षेत्र (यानी इंजेक्शन के साइट) को मिलाते हुए. हालांकि चूहों CYP2D6 मॉडल में जिगर के लिए एक भारी क्षति प्रदर्शन, चूहों स्वस्थ लगते हैं और दुख, दर्द या तनाव के कोई संकेत नहीं दिखा. फिर भी, सीरम aminotransferases जैसे गंभीर जिगर की विफलता के संकेतकों के एक नियमित आधार पर निर्धारित कर रहे हैं या प्रदर्शन प्रयोगों का हिस्सा हैं. > 1000 यू / एल के सीरम aminotransferase स्तर केवल वायरस के संक्रमण का एक सीधा परिणाम के रूप में प्रकट करना चाहिए, लेकिन लंबे समय नहीं है. यदि सीरम aminotransferase स्तर 1000 के ऊपर लंबे समय से यू / एल (गंभीरता सीमा) चूहों का बलिदान कर रहे हैं. 2. माउस आँख से खून बह रहा 4 एक संज्ञाहरण कक्ष में isoflurane% के साथ माउस असंवेदनता उत्पन्न करना. हिंद पैर चुटकी यकीन है कि पशु anesthetized है. गर्दन के पीछे से पकड़ माउस और अंगूठे और मध्यम उंगली के साथ सिर की ढीली त्वचा कस. इस तरह, आंखों से थोड़ा protrudesआँख करने के लिए आसन्न त्वचा के लिए कर्षण. आंख और धीरे कम या भीतरी कोने में केशिका ट्यूब की टिप प्लेस लेकिन दृढ़ता के साथ नेत्रगोलक नेत्र शिरापरक साइनस गिरावट. शिरापरक के capillaries का टूटना और जिसके परिणामस्वरूप नकसीर कक्षीय गुहा भरता है. थोड़ा केशिका ट्यूब को वापस लेने टिप मुक्त इतना है कि जमा रक्त ट्यूब में तैयार की है. जब पर्याप्त रक्त एकत्र किया जाता है, ट्यूब वापस ले लिया है और पलकें बंद. खून बह रहा है ट्यूब की वापसी और शिरापरक जटिल पर सामान्य आंख का दबाव के reestablishment पर बंद हो जाता है. केशिका ट्यूब में रक्त एक Microtainer ट्यूब के लिए स्थानांतरित कर रहा है और बर्फ पर 30 मिनट के लिए incubated रहे. 2 मिनट के लिए 7500 XG Microtainer ट्यूब पर 4 डिग्री सेल्सियस पर Centrifuged सतह पर तैरनेवाला सीरम है जो एक ताजा ट्यूब के लिए स्थानांतरित कर रहा है और -80 में संग्रहीत डिग्री सेल्सियस से मेल खाती है सीरम के लिए एलिसा प्रतिरक्षी अनुमापांक द्वारा निर्धारित किया जा सकता है. इंडिकायकृत एंजाइमों alanine aminotransferase (ALT / GPT) और aspartate aminotransferase मूल्यांकन किया जा सकता है (AST मिला /) के सीरम स्तर के अनुसार Roche Diagnostics से परीक्षण स्ट्रिप्स (मैनहेम, जर्मनी) और एक Reflotron प्लस विश्लेषक (का उपयोग कर के रूप में जिगर की क्षति के tors Roche Diagnostics, मैनहेम, जर्मनी). वैकल्पिक रूप से, रक्त नमूने पूंछ नस के माध्यम से या सतही अस्थायी 11 नस के माध्यम से किया जा सकता है. 3. माउस जिगर छिड़काव टिप्पणी: यह कदम महत्वपूर्ण है रक्त लिम्फोसाइटों द्वारा पृथक जिगर लिम्फोसाइटों के संक्रमण से बचने सीओ 2 की घातक खुराक गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था के बाद के द्वारा माउस Euthanize के. स्टायरोफोम बोर्ड पर अपनी पीठ पर बिछाने पशु माउंट. 23 जी सुई का प्रयोग extremities पिन. Moisturize और माउस के साथ 70% EtOH कीटाणुरहित पिछले पैरों से दूर 1 सेमी के बारे में, के माध्यम से एक चीरा बनाने केत्वचा और मांसपेशियों परत. डायाफ्राम के लिए काम कर पशु के दोनों पक्षों पर कट. जब डायाफ्राम तक पहुँच जाता है त्वचा पीछे की ओर से फ़्लिप किया जा सकता है. डायाफ्राम rips से दूर कटौती तो रग Cava कटौती. पेट और पक्ष को बंद आंतों ले जाएँ, पोर्टल नस उजागर. एक 27 जी 5 मिलीलीटर सिरिंज ठंड पीबीएस के साथ भर से जुड़ा सुई डालने पोर्टल शिरा में. पीबीएस धीरे जिगर के खून बाहर धोने. डायाफ्राम पर हथियाने और डायाफ्राम शरीर से दूर काटने से जिगर के टुकड़े करना. एक पेट्री डिश में जिगर स्थानांतरण और डायाफ्राम हटाने के जिगर, पित्ताशय की थैली और किसी भी अन्य ऊतकों से जुड़े 10 मिलीलीटर पीबीएस बर्फ पर एक 50 मिलीलीटर की ट्यूब में जिगर या स्थानांतरण, अक्टूबर परिसर में एम्बेड. 4. जिगर लिम्फोसाइटों का अलगाव निम्नलिखित स्टॉक समाधान तैयार: Collagenase IV (100 मिलीग्राम / एमएल) मैं स्टॉकपता पीबीएस. (-20 डिग्री सेल्सियस पर छोटे aliquots और दुकान करें). DNase पीबीएस में स्टॉक (25 मिलीग्राम / एमएल). (-20 डिग्री सेल्सियस पर छोटे aliquots और दुकान करें). Collagenase बफर: पीबीएस 0.2 मिलीग्राम / मिलीग्राम Collagenase चतुर्थ, 0.02 मिलीग्राम / मिलीग्राम DNase और 5% एफसीएस युक्त, 1 जिगर के लिए, 9.5 मिलीग्राम बहुत ठंडा Pbs, 20 μl Collagenase चतुर्थ (100 स्टॉक मिलीग्राम / एमएल), 8 μl DNase मिश्रण ( 25 मिलीग्राम / एमएल शेयर), और 500 μl गर्मी निष्क्रिय FCS. 35% Percoll, मिश्रण 175 मिलीलीटर Percoll, 20 मिली 10 x पीबीएस स्टॉक, 305 मिलीलीटर पीबीएस. RPMI = RPMI 10% गर्मी से निष्क्रिय है FCS, 100 μ / एमएल पेनिसिलिन, 100 μg / मिलीलीटर स्ट्रेप्टोमाइसिन, 2 मिमी एल glutamine युक्त. बर्फ पर एक पेट्री डिश में 10 मिलीलीटर ताजा पीबीएस के स्थानांतरण perfused जिगर (3 अनुभाग देखें) और छोटे कैंची का उपयोग कर टुकड़े में काट. एक गिलास मूसल या एक 2 मिलीलीटर सिरिंज से एक पैर के साथ के माध्यम से एक 70 माइक्रोन सेल झरनी और निचोड़ जिगर junks में स्थानांतरण. ध्यान से 10 मिलीलीटर ठंड Collagenase बफर और जोड़नेझरनी के माध्यम से दबाएँ. निलंबन और झरनी के माध्यम से फिल्टर दो बार अधिक ले लीजिए. बर्फ पर ताजा 50 मिलीलीटर ट्यूब के के निलंबन का स्थानांतरण. अगले जिगर की प्रक्रिया. 37 ° सेल्सियस पर 60 मिनट के लिए जिगर सेल निलंबन सेते हैं, धीरे हर 15 मिनट के मिश्रण. 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए 30 XG पर अपकेंद्रित्र एक ताजा ट्यूब स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला, गोली के ऊपर 5 मिमी द्रव छोड़ने 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 650 XG पर अपकेंद्रित्र सतह पर तैरनेवाला त्यागें, गोली ऊपर 3 मिमी छोड़ने 20 मिलीलीटर Percoll बफर में resuspend गोली 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 600 XG पर अपकेंद्रित्र ट्यूब flicking द्वारा सतह पर तैरनेवाला और resuspend गोली त्यागें. पीबीएस के साथ गोली 1 एक्स धो लें. पूरा RPMI के साथ गोली 1 एक्स धो 3 मिलीग्राम RPMI में resuspend गोली पूरा और 1:10 कमजोर पड़ने में कोशिकाओं की गिनती. ~ 10 RPMI में 7 कोशिकाओं / मिलीलीटर में resuspend कोशिकाओं को पूरा करने और बर्फ ट्यूब हस्तांतरण. </ol> 5. Intracellular साइटोकाइन धुंधला (ICCS) 5.1 उत्तेजना: ~ 7 10 कोशिकाओं / एमएल पर पूरा RPMI के रूप में वर्णित में जिगर लिम्फोसाइटों की तैयारी. प्लेट 100 (10 6 कोशिकाओं) μl / अच्छी तरह से एक फ्लैट 96 अच्छी तरह से थाली है जो ऊतक संस्कृति इलाज नहीं है में. जोड़ें 50μl RPMI 2μg/ml Brefeldin युक्त पूरा एक तो और जोड़ 50μl RPMI पूरा 2 μg / मिलीलीटर CYP2D6 पेप्टाइड उत्तेजक युक्त (यानी immunodominant सीडी 4 का मिलान CYP2D6 41-60 PGLGNLLHVD 12 FQNTPYCFDQ या immunodominant सीडी 8 मिलान CYP2D6 193-212 RRFEYDDPRF 12 LRLLDLAQEG). Pipetting द्वारा मिश्रण. 37 में 5 घंटे के लिए सेते हैं डिग्री सेल्सियस (इष्टतम उत्तेजना समय पर रातोंरात ऊष्मायन के रूप में अच्छी तरह से काम करता है). 5.2. धुंधला: निम्नलिखित स्टॉक समाधान तैयार: FACS बफर: पीबीएस% 1 भ्रूण है बछड़ा युक्तerum (एफसीएस). FACS 0.1% सैपोनिन और 4% paraformaldehyde के युक्त बफर / निर्धारण Permeabilization बफर: FACS / सैपोनिन धो बफर: FACS 0.1% सैपोनिन युक्त बफर FACS / पीएफए ​​बफर: FACS बफर 1% (पीएफए) paraformaldehyde युक्त वि नीचे microtiter प्लेट (96 अच्छी तरह से) में कोशिकाओं को स्थानांतरण और 4 में 3 मिनट के लिए 460 XG पर स्पिन डिग्री सेल्सियस मध्यम और भंवर थाली त्यागें 4 में 3 मिनट के लिए 460 XG पर 150 μl FACS बफर और अपकेंद्रित्र जोड़ें डिग्री सेल्सियस मध्यम और भंवर थाली त्यागें. दोहराएँ कदम धोने. ब्लॉक सतह 1 / μg मिलीलीटर FACS बफर में में αCD16/32 (FCR ब्लॉक) डिग्री सेल्सियस 4 में 15 मिनट और 150 μl धुंधला बफर के साथ 2 एक्स धो (पर 2 मिनट के लिए 460 XG के लिए कॉकटेल के साथ यदि आवश्यक FCR (माध्यमिक एंटीबॉडी का उपयोग करते समय) 4 डिग्री सेल्सियस). सतह अणुओं के लिए दाग: यानी मैब विरोधी CD8a – FITC 10 / μg में 30 मिनट 4 ° अंधेरे में सी के लिए 50 μl FACS बफर में मिलीलीटर. 100 μl FACS जोड़ेंबफर और 3 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 460 XG स्पिन कोशिकाओं 150 μl FACS बफर (, 3 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस 460 XG) के साथ 2 एक्स धो. भंवर थाली. फिक्स / आरटी पर 10 मिनट के लिए 100 μl / निर्धारण permeabilization बफर के साथ कोशिकाओं permeabilize. 7 मिनट के लिए 460 XG पर स्पिन में 4 डिग्री सेल्सियस ध्यान दें कि यह महत्वपूर्ण है के लिए 7 मिनट centrifugation समय का विस्तार करने के लिए, के बाद से निर्धारण / permeabilzation कदम कोशिकाओं की समग्र घनत्व में परिवर्तन. भंवर थाली. 150 μl FACS / सैपोनिन धो बफर (, 7 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस 460 XG) के साथ 2 एक्स धो लें. भंवर थाली. अणुओं के लिए intracellular दाग: अर्थात् एंटी – IFNγ पीई 10 μg / 50 μl / 30 मिनट के लिए FACS सैपोनिन धो बफर में मिलीलीटर 4 बजे डिग्री सेल्सियस मैब 7 मिनट के लिए 460 XG पर 4 बजे 100 μl FACS / सैपोनिन धो बफर और स्पिन जोड़ें डिग्री सेल्सियस कोशिकाओं 150 μl FACS / सैपोनिन धो बफर (, 7 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस 460 XG) के साथ 2 एक्स धो. भंवर थाली. कोशिकाओं 1 FACS बफर के साथ (x, 7 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस 460 XG) धो. भंवर थाली. </lमैं> प्रवाह cytometry द्वारा डेटा के अधिग्रहण तक 200 μl FACS / पीएफए ​​बफर, ट्यूबों में स्थानांतरण, और दुकान 4 बजे ° सी अंधेरे में है में resuspend कोशिकाओं. हम आम तौर पर एक FACSCanto द्वितीय या एक FACSCalibur (बी.डी. बायोसाइंसेज, हीडलबर्ग, जर्मनी) का उपयोग करें. 6. विशेष तकनीक द्वारा ऊतकों में विशिष्ट एन्टिजनों का प्रदर्शन 6.1. सामान्य जिगर विकृति विज्ञान के मूल्यांकन के लिए एच ई धुंधला: फसल जिगर ऊतक टेक अक्टूबर में एक डिस्पोजेबल आधार मोल्ड और सूखी बर्फ पर जल्दी से जमाना में विसर्जित. कट 7 माइक्रोन जिगर ऊतक वर्गों का उपयोग कर एक Leica -17 पर सेट cryostat डिग्री सेल्सियस और Superfrost प्लस खुर्दबीन स्लाइड पर ऊतक वर्गों माउंट. -20 में दुकान स्लाइड डिग्री सेल्सियस तक आगे का उपयोग. -20 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए पूर्व ठंडा EtOH में cryosections फिक्स 10 मिनट के लिए सूखी. कमरे के तापमान पर 2 मिनट (6.1.13, कमरे के तापमान पर प्रदर्शन कर रहे हैं निम्नलिखित कदम, 6.1.5) के लिए आसुत जल में धो 2 एक्स. के लिए है मेयेर Hematoxylin समाधान में दाग8 मिनट. गर्म में 10 मिनट के लिए धो (30 डिग्री सेल्सियस) पानी के नल. कई बार पानी बदलें. आसुत पानी में कुल्ला. 20 सेकंड के लिए 95% EtOH में कुल्ला. 40 सेकंड के लिए लाल भामसान रंग समाधान / जी वाई में Counterstain. ऊष्मायन प्रति 5 मिनट के लिए 95% EtOH में 2 एक्स निर्जलीकरण. ऊष्मायन प्रति 5 मिनट के लिए 100% EtOH में 2 एक्स निर्जलीकरण. समाशोधन प्रति 5 मिनट के लिए xylene 2 एक्स में रिक्त करें. रोटी – Histokitt में माउंट. 6.2. कोलेजन मैं बयान के लिए immunohistochemistry: फसल जिगर ऊतक टेक अक्टूबर में विसर्जित कर दिया. एक डिस्पोजेबल आधार मोल्ड और सूखी बर्फ पर जल्दी से जमाना में. कट 7 माइक्रोन जिगर ऊतक वर्गों का उपयोग कर एक Leica -17 पर सेट cryostat डिग्री सेल्सियस और Superfrost प्लस खुर्दबीन स्लाइड पर ऊतक वर्गों माउंट. -20 में दुकान स्लाइड डिग्री सेल्सियस तक आगे का उपयोग. में ठंड EtOH में -20 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए cryosections फिक्स 10 मिनट के लिए सूखी. पीबीएस में कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए 2 एक्स धो. <li> सेते हैं पीबीएस में 0.3% एच 2 2 हे और कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 0.1% ना के azide युक्त. पीबीएस में कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए 2 एक्स धो. Avidin – बायोटिन अवरुद्ध निर्माता के दिशा निर्देशों के अनुसार किट के साथ ब्लॉक. एफसीएस पीबीएस (एफसीएस / PBS) में 10% के साथ कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए ब्लॉक. प्राथमिक एंटीबॉडी एक खरगोश विरोधी माउस कोलेजन मैं प्रतिरक्षी है जो 10% / FCS पीबीएस में 1:200 पतला है है. कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ वर्गों को सेते हैं. अनुभाग 4 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर पीबीएस में 3 एक्स धो. 1:500 के लिए biotinylated विरोधी खरगोश एंटीबॉडी पतला और 1.5 घंटे के लिए वर्गों के साथ कमरे के तापमान पर सेते हैं. अनुभाग 4 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर पीबीएस में 3 एक्स धो. रंग प्रतिक्रिया avidin peroxidase संयुग्म और निर्माता के दिशा निर्देशों के अनुसार diaminobenzidine हाइड्रोजन पेरोक्साइड के साथ अनुक्रमिक ऊष्मायन द्वारा प्राप्त किया जाता है. वह मेयर के Counterstain5 मिनट के लिए matoxylin समाधान, पीबीएस में कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए 2 एक्स और धोने Aquatex में माउंट. 7. प्रतिनिधि परिणाम विज्ञापन 2D6 प्रेरित जिगर की क्षति के दो अलग – अलग चरणों के साथ चूहों के संक्रमण. संक्रमण के बाद पहले दिन में, जिगर का वायरस संक्रमण सीरम aminotransferase स्तर, hepatocyte 6 मौत का एक संकेतक के एक तीव्र वृद्धि का कारण बनता है. यह पहली, तीव्र चरण hCYP2D6 की अभिव्यक्ति की स्वतंत्र होता है और एक खाली नियंत्रण (नियंत्रण विज्ञापन) वायरस या एक व्यक्त वायरस हरी प्रतिदीप्ति प्रोटीन (विज्ञापन GFP) के साथ संक्रमण के बाद भी देखा जा सकता है. इसके विपरीत में, दूसरे चरण autoimmune की मध्यस्थता और ट्रिगर hCYP2D6 अणु की अभिव्यक्ति पर निर्भर है. इस autoimmune चरण 2-4 सप्ताह के भीतर संक्रमण के बाद होता है और कई 6 महीने के लिए बनी रहती है. <पी वर्ग = "jove_content"> चित्रा 1. CYP2D6 मॉडल wildtype. FVB या C57BL / 6 चूहों विज्ञापन 2D6 की दो खुराकों (नसों में और intraperitoneal) के साथ अंतःक्षिप्त रहे हैं. ब्याज की एक समय में जिगर और सीरम एकत्र कर रहे हैं और जिगर की क्षति और hCYP2D6 विशिष्ट एंटीबॉडी और टी कोशिकाओं के गठन के लिए मूल्यांकन. निम्नलिखित विशेषताएं wildtype FVB या C57BL / CYP2D6 मॉडल में 6 चूहों के विज्ञापन 2D6 संक्रमण के बाद लगातार autoimmune हैपेटाइटिस के विकास के लिए लक्षण हैं: पहले, जिगर aberrantly बदल आकारिकी से पता चलता है. विशेष रूप से, जिगर lobes में जुड़े हुए हैं, hyperplasic पिंड पूरे जिगर और एक विशाल सम्पुटी तंतुमयता दिख रहा है (2 आंकड़ा) पर बिखरे हुए दिखाई देते हैं. चित्रा 2. जिगर आकारिकी ठेठ जिगर की क्षति विज्ञापन – 2D6 प्रेरित के रूप में 4 सप्ताह के बाद संक्रमण के पर पता चला. ध्यान दें कि व्यक्ति जिगर lobes (तीर) में जुड़े हुए हैं. Hyperplasic पिंड पूरे जिगर (तीर) पर बिखरे हुए दिखाई देते हैं. एक नियंत्रण व्यक्त hCYP2D6 नहीं adenovirus साथ संक्रमण जिगर आकारिकी पर कोई प्रभाव नहीं है. दूसरा, व्यापक और लगातार सेलुलर घुसपैठ विज्ञापन – 2D6 संक्रमित नहीं बल्कि विज्ञापन नियंत्रण संक्रमित चूहों (आंकड़ा 3A) के यकृत की पेरी पोर्टल और parenchymal क्षेत्रों में दिखाई देते हैं. तंतुमयता मुख्य रूप से कुछ कोलेजन पैरेन्काइमा (3B आंकड़ा) में फैला हुआ बंडलों साथ subcapsular क्षेत्र में विकसित करता है. चित्रा 3. जिगर ऊतक विज्ञान: जिगर FVB या 4 सप्ताह के बाद संक्रमण के पर विज्ञापन 2D6 विज्ञापन नियंत्रण के साथ संक्रमित चूहों के ऊतक अनुभाग एच ई धुंधला. ध्यान दें कि mononuclear कोशिकाओं के महत्वपूर्ण घुसपैठ केवल विज्ञापन 2D6 संक्रमित चूहों में मौजूद हैं (एकल) तीर. ट्रिपल तीर जिगर पैरेन्काइमा ब्रिजिंग पड़ोसी पोर्टल इलाकों के बीच में बड़ा सेलुलर घुसपैठ से संकेत मिलता है. बी: विज्ञापन 2D6 या विज्ञापन नियंत्रण के साथ संक्रमण के बाद 4 सप्ताह में जिगर तंतुमयता के immunohistochemical प्रतिनिधित्व. जिगर वर्गों को कोलेजन विरोधी कोलेजन मैं एंटीबॉडी का उपयोग करने के लिए किया गया है दाग है. जिगर कैप्सूल कुछ पैरेन्काइमा (एक तीर) और घुसपैठ कोशिकाओं (तीर) के बड़े समूहों की उपस्थिति में फैला हुआ बंडलों के साथ (ट्रिपल तीर) के तहत नोट कोलेजन स्वभाव के कई परत. दो प्रतिनिधि जिगर वर्गों प्रत्येक शर्त के लिए प्रदर्शित कर रहे हैं. आकार सलाखों: 100μm. एक तीसरा सुविधा विरोधी CYP2D6 एंटीबॉडी का उच्च titers, जो मानव LKM 1 6,13 एंटीबॉडी के लिए एक समान का मिलान विशिष्टता है की पीढ़ी है. अंतिम, hCYP2D6 विशेष CD4 और CD8 टी कोशिकाओं उत्पन्न कर रहे हैं कि मुख्य रूप से जिगर के लिए घर है. इस तरह के hCYP2D6 विशेष टी कोशिकाओं immunodomi साथ उत्तेजना के द्वारा पता लगाया जा सकता हैNant hCYP2D6 पेप्टाइड्स और intracellular साइटोकाइन (ICCS) धुंधला (आंकड़ा 4) द्वारा IFNγ अभिव्यक्ति के बाद माप. hCYP2D6 विशेष CD8 टी कोशिकाओं 12 vivo में विज्ञापन – 2D6 संक्रमित लक्ष्य कोशिकाओं को मारने. चित्रा 4. hCYP2D6 विशेष टी कोशिकाओं. फ्लो hCYP2D6 विशेष टी कोशिकाओं की cytometric विश्लेषण. जिगर लिम्फोसाइटों विज्ञापन 2D6 संक्रमण के बाद 4 सप्ताह में पृथक किया गया है और या तो immunodominant सीडी 4 या सीडी 8 hCYP2D6 रात भर का मिलान के साथ प्रेरित किया गया. IFNγ की पीढ़ी intracellular साइटोकाइन धुंधला द्वारा पाया गया था और एक FACS सर्ग II (बी.डी. बायोसाइंसेज, हीडलबर्ग, जर्मनी) का उपयोग कर प्रवाह cytometry द्वारा विश्लेषण किया. hCYP2D6 विशिष्ट CD4 और CD8 कोशिकाओं का प्रतिशत संकेत दिया है.

Discussion

पिछले अध्ययनों में, प्रयोगात्मक हैपेटाइटिस अक्सर केवल autoimmune जिगर की बीमारी के लिए क्षणिक और कई मौजूदा मॉडल एक नहीं बल्कि जटिल रोग शामिल प्रोटोकॉल (समीक्षा के लिए ^3,5 देखना) पर निर्भर था. उदाहरण के लिए, कई मॉडल ट्रांसजेनिक चूहों का उपयोग लक्ष्य विशिष्ट एंटीजन व्यक्त है और adoptively ^14,15 प्रतिजन विशेष ज्यादातर TCR ट्रांसजेनिक, टी कोशिकाओं लक्ष्य स्थानांतरित. अक्सर livertropic वायरस, बैक्टीरिया या परजीवी के साथ एक अतिरिक्त संक्रमण ^16-18 रोग पैदा करने के लिए आवश्यक है. वैकल्पिक रूप से, ¹⁹ CYP2D6 लक्ष्य प्रतिजनों,, के लिए एन्कोडिंग प्लास्मिड डीएनए टीकाकरण हैपेटाइटिस प्रेरित करने के लिए प्रयोग किया जाता है. हालांकि, आईएल -12 के रूप में समर्थक भड़काऊ साइटोकिन्स, के लिए एन्कोडिंग प्लास्मिड के साथ एक अतिरिक्त टीकाकरण ²⁰ की आवश्यकता है. दुर्भाग्य से, कुछ अपवादों के साथ ^15,20 हेपेटाइटिस केवल क्षणिक है.

CYP2D6 ^6,21 मॉडल टी का उपयोग करता है एक सरल तरीकाबस एक, ^7,8 AIH 2 में प्रमुख स्वप्रतिजन hCYP2D6 व्यक्त Adenovirus के साथ चूहों को संक्रमण से autoimmune हैपेटाइटिस प्रेरित ओ. CYP2D6 का एक adenovirus निर्माण के द्वारा डिलिवरी दोनों जिगर का एक सीधा लक्ष्यीकरण के रूप में अच्छी तरह के रूप में एक स्थानीय सूजन है कि सहिष्णुता के टूटने को बढ़ावा देता है की गारंटी देता है. यह महत्वपूर्ण है लेकिन ध्यान रखें कि दोनों वायरस के रूप में अच्छी तरह से प्रशासन के मार्ग अनुमापांक इस मॉडल के लिए महत्वपूर्ण है. एक हाथ पर, विज्ञापन 2D6 एक प्रतिकृति की कमी वायरस है, इस प्रकार, वायरस की एक पर्याप्त उच्च अनुमापांक जिगर के भीतर प्रतिजन की एक महत्वपूर्ण राशि उत्पन्न करने के लिए आवश्यक है. दूसरी ओर, बहुत अधिक अनुमापांक एक घातक तीव्र जिगर की विफलता में परिणाम हो सकता है. इसके अलावा, यह पहले से दिखा दिया है कि adenovirus के उच्च titers द्वारा चूहों के संक्रमण प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया ²² के कार्यात्मक थकावट की ओर जाता है. हमारे मॉडल में, हम नसों और intraperitoneal संक्रमण का एक संयोजन का उपयोग किया क्रम में दोनों पुरानी सेलुलर के रूप में के रूप में अच्छी तरह से घुसपैठ ext प्राप्तensive तंतुमयता. हमने देखा है कि अकेले नसों में संक्रमण अभी भी बड़े पैमाने पर सेलुलर घुसपैठ का कारण बनता है, लेकिन subcapsular क्षेत्र का कोई फाइब्रोसिस कि peritoneal intraperitoneal इंजेक्शन के कारण सूजन का संकेत कोलेजन की निरंतर subcapsular संचय (Hintermann और बप्तिस्मा तैयारी में पांडुलिपि) में शामिल किया जा सकता है. हालांकि, यह नोट करना महत्वपूर्ण है कि मनाया यकृत तंतुमयता प्रतिजन विशिष्ट है, के बाद से हम विज्ञापन GFP या ²³ विज्ञापन नियंत्रण के बराबर वायरस titers के साथ यकृत तारामय कोशिकाओं और कोलेजन बयान की सक्रियता का पता नहीं लगा था संक्रमण के बाद.

CYP2D6 मॉडल मानव AIH ^1,2 की पुरानी लगातार सेलुलर घुसपैठ और जिगर तंतुमयता ⁶ द्वारा विशेषता हेपेटाइटिस जैसे कई पहलुओं को दर्शाता है. इसके अलावा, उच्च टिटर इसी तरह का मिलान विशिष्टता और LKM – 1 AIH – 2 रोगियों में पाया एंटीबॉडी के लिए ¹³ के प्रसार के साथ विरोधी CYP2D6 एंटीबॉडी की उपस्थिति पूर्व इंगित करता हैएक आम पुरानी autoimmune जेट की भावना. CYP2D6 AIH-2 में प्रमुख प्रतिजन है, लेकिन यह अधिक अक्सर प्रकार 1 AIH साथ रोगियों का निदान द्वारा मान्यता प्राप्त नहीं है. इसके अलावा, autoimmune एटियलजि के साथ अन्य जिगर प्राथमिक पैत्तिक सिरोसिस (PBC) या प्राथमिक sclerosing पित्तवाहिनीशोथ (पीएससी) के रूप में, रोगों से पीड़ित रोगियों, बानगी autoantibodies उत्पन्न अलग के जिगर autoantigens और उनके यकृत को विशिष्टता के साथ विभिन्न रोग छोटे पर केंद्रित विशेषताएं (PBC बताते हैं ) या बड़े (पीएससी) पित्त नलिकाएं. फिर भी, CYP2D6 मॉडल के immunopathogenic autoimmune यकृत रोग के दौरान होने वाली hepatocytes के autoimmune विनाश ड्राइव और संभव उपचारात्मक उपायों का मूल्यांकन करने के लिए बीमारी का इलाज करने के लिए प्रमुख खिलाड़ियों की पहचान के रूप में पुरानी यकृत सूजन प्रक्रियाओं में शामिल तंत्र का विश्लेषण करने के लिए अवसर प्रदान करता है.

Materials

Name of the equipment	Company	Catalogue number	Comments
23G needle	BD Biosciences	300800
27½G needle	VWR	612-0151
30½ G needle	BD Biosciences	304000
Alanine aminotransferase test strips (GPT/ALT)	Roche Diagnostics	10 745 138 202
Aspartate aminotransferase test strips (GOT/AST)	Roche Diagnostics	10 745 120 202
Anaesthesia Unit Univentor 400	AgnTho’s
Base molds, disposable 37x24x10 mm	VWR	720-0208
Cell strainer 70mm	VWR	734-0003
Cryostat	Leica	CM1850 UV
Heparinized capillary tubes	Fisher	3123987
Microscope slides Superfrost Plus	Menzel Gläser	J1800AMNZ
Microtainer SST tubes	BD Biosciences	365951
Microtiter plates, V-bottom	VWR	391-1924
Reflotron Plus	Roche Diagnostics		Determiniation of serum AST / ALT
Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
Rabbit anti-mouse anti-Collagen type I IgG,	Chemicon	AB765P
Biotinylated goat anti-rabbit IgG	Vector (AXXORA)	VC-BA-1000-MC15
FITC-conjugated anti mouse CD8a antibody	Southern Biotech	1550-02
PE-conjugated anti mouse IFNγ antibody	BD Biosciences	554412
PE-conjugated anti-mouse CD16/CD32 antibody (FcR block)	BD Biosciences	553141
Aquatex	VWR	1.08562.0050
Avidin/Biotin Blocking kit	Vector (AXXORA)	VC-SP-2001-KI01
Brefeldin A	Sigma	B6542
Collagenase IV	Sigma	C5138-100MG
DAB substrate kit 3’3’diaminobenzidine	Vector (AXXORA)	VC-SK-4100-KI01
DNase	Sigma	DN-25
Elite ABC Reagent	Vector (AXXORA)	VC-PK-7100-L050
Eosin G/Y solution	Roth	X883.1
Fetal calf serum (FCS)	Biochrom AG	S 0115
Isofluran	Forene	B506
Meyer’s Hematoxylin solution	AppliChem	A4840,1000
OCT Compound	Sakura Finetek Europe	4583
PBS-buffered formaldehyde 10%	Roth	A146.3
Percoll	Amersham	17-0891-01
Roti-Histokit	Roth	6638.1
RPMI	Invitrogen	61870
Saponin from quillaja bark	Sigma	S7900