Genoverførsel til udviklingslandene Mouse indre øre af<em> In Vivo</em> Elektroporation
Summary
Musen indre øre er et placode-afledt sanseorgan, hvis udviklings-program er udarbejdet under svangerskabet. Vi definerer en<em> In utero</em> Genoverførsel teknik bestående af tre trin: mus ventrale laparotomi, transuterine mikroinjektion, og<em> In vivo</em> Elektroporering. Vi bruger digital video mikroskopi at påvise de kritiske eksperimentelle embryologiske teknikker.
Abstract
Pattedyr indre øre har seks særskilte sensoriske epithel: 3 cristae i ampuller af de halvcirkulære kanaler, maculae i utricle og saccule og det cortiske organ i den opspolede cochlea. Den cristae og maculae indeholder vestibulære hårceller, som transducerer mekaniske stimuli til subserve den særlige følelse af balance, mens auditive hårceller i organet for Corti er de primære transducere for at høre 1. Cell skæbne specifikation i disse sensoriske epitel og morfogenese af de halvcirkelformede kanaler og cochlea finde sted i den anden uge af svangerskabet i musen og er stort set fuldført før fødslen 2,3. Udviklingsmæssige undersøgelser af mus indre øre rutinemæssigt udføres ved at høste transgene embryoner på forskellige embryoniske eller postnatal trin at få indsigt i den molekylære basis for cellulær og / eller morfologiske fænotyper 4,5. Vi hypotesen, at gen-overførsel til udviklingslandene musen indre øre in utero </ Em> i forbindelse med gevinst-og tab af funktion undersøgelser repræsenterer en gratis tilgang til traditionel mus transgenese for afhøringen af de genetiske mekanismer bag pattedyr indre øre udvikling 6.
Den eksperimentelle paradigme at gennemføre gen misexpression undersøgelser i udviklingslandene mus indre øre vist her opløser i tre generelle trin: 1) ventrale laparotomi, 2) transuterine mikroinjektion og 3) in vivo elektroporation. Ventrale laparotomi er en mus overlevelse kirurgisk teknik, der tillader udlægning af livmoderen for at få eksperimentelle adgang til de implanterede embryoer 7. Transuterine mikroinjektion er anvendelsen af affasede, glas kapillære mikropipetter til at indføre ekspressionsplasmid ind i lumen af otisk vesikel eller otocyst. In vivo elektroporation er anvendelsen af firkantbølge, direkte strømimpulser til at drive ekspression plasmid i progenitorceller 8-10.
<p class = "jove_content"> Vi har tidligere beskrevet dette elektroporation-baseret genoverførsel teknik og omfattede detaljerede noter på hvert trin af protokollen 11. Mus eksperimentelle embryologiske teknikker kan være svært at lære af prosa og stillbilleder alene. I det foreliggende arbejde, viser vi de 3 trin i gen-transfer. Mest kritisk, vi implementere digital video mikroskopi for at vise præcis, hvordan man: 1) at identificere embryo orientering i livmoderen, 2) drej embryoner til målretning injektioner til otocyst, 3) microinject DNA blandet med sporstof farvestof opløsningen i otocyst på embryonale dag 11.5 og 12,5; 4) elektroporere den injicerede otocyst og 5) label elektroporeret embryoner til postnatal valg ved fødslen. Vi leverer repræsentative eksempler på succes transficeret indre ører, en billedlig guide til de mest almindelige årsager til otocyst mistargeting, drøfte, hvordan man kan undgå fælles metodologiske fejl, og de nuværende retningslinjer for at skrive en in utero gØNØ overførsel dyrepleje protokol.Protocol
Discussion
Genoverførsel til udviklingslandene musen indre øre: Musen indre øre udvikler sig fra øret placode løbet af den første uge af implantation udvikling 12,13. Ved embryonisk dag 9,5 (E9.5) har placode sammentrækningsorgan og forvandlet til en væskefyldt blære kaldet otocyst 2. Otisk forstadier i vesiklen giver anledning til de sensoriske og nonsensory celler i det modne indre øre, samt de neuroner, der innerverer mekanisk sensitive hårceller i det vestibulære og auditive s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Humana Press om tilladelse til at offentliggøre mikroinjektion pipette fabrikation tal, der oprindeligt blev vist på side 130 reference 11, Larry Dlugas og Steven Wong, OHSU Department of Educational Communications, for videography, Larry Dlugas til video design og redigering; Adam M. O "Quinn, Senior Designer, Trion / Envirco for at designe vores kunder horisontal laminar flow hætte og Les Goldsmith til at yde teknisk skematiske, Victor Monterroso, MV, MS, ph.d. og Tom Chatkupt, DVM, OHSU Institut for Sammenlignende Medicin, vejledning med vores dyrepleje protokol, kirurgiske teknikker, og profylaktisk analgesi regime; Marcel Perret-Gentil, DVM, MS, for at dele sine handout om veterinære sutureringsteknikker, Edward Porsov, MS, for at designe vores Adobe Premiere Pro video mikroskopi computerarbejdsplads og Leah White og jonas Hinckley af LMS Captioning (Portland, OR). Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Institute on Døvhed og other Communication Disorders: DC R01 008595 og DC R01 008.595-04S2 (til JB) og P30 DC005983 (Oregon Hearing Research Center Core Grant, Peter Gillespie, Principal Investigator).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Micro Sterilizing Case | ROBOZ | RS-9900a | 8X8.5X1.25 inches |
| Ball-tipped scissors | Fine Science Tools | 14109-09 | |
| Ring forceps | Fine Science Tools | 11106-09 | 4.8mm ID/6mm OD |
| Adson Tissue Forceps | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Needle driver | Fine Science Tools | 12502-12 | |
| Allergy Syringe Tray | Becton Dickison | 305536 | |
| Suture 6-0 | Syneture | GL-889 | 0.7 metric gastrointestinal suture |
| Lactated Ringer’s Injection USP | Baxter | 2B2323 | |
| Fast green | Sigma Aldrich | F7258 | |
| Borosilicate glass capillary | Harvard Apparatus | 30-0053 | |
| Nembutal Sodium Solution | OVATION Pharmaceuticals Inc. | NDC 67386-501-52 | |
| MgSO4.7H2O | Fisher Scientific | M63-500 | |
| Propylene glycol | Fisher Scientific | P355-1 | |
| Ethanol | Sigma Aldrich | E7023-500 | |
| Meloxicam | Boehringer Ingeheim | NADA 141-219 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-97 | FB255B box filament; consult Pipette Cookbook from Sutter instruments |
| Microelectrode Beveler | Sutter Instruments | BV-10 | 104C beveling disk for large pipettes; consult owner’s manual for beveling theory |
| Micropipette holder | Warner Instruments | MP-S15T | For 1.5mm outer diameter pipette and female pressure port for Picospritzer tubing. |
| Tweezers-style electrode | Protech International Inc. | CUY650P5 | 5 mm outer diameter |
| Square Wave Electroporator | Protech International Inc. | CUY21EDIT | Footpedal recommended |
| PICOSPRITZER III | Parker Hannifin | 051-0500-900 | Footpedal recommended |
| Manual Control Micromanipulator | Harvard Apparatus | 640056 | |
| Horizontal laminar flow clean bench | Envirco | Custom modifications to LF 630-10554. See supplementary information for hood schematic. | |
| Leica stereofluorescence dissecting microcope with Lumencor SOLA light engine | Bartels and Stout and Lumencor | MZ10F with Lumencor SOLA light engine | Footpedals to focus the MZ10F and to trigger the SOLA light engine are recommended |
| Alexa Fluor 594 Dextran | Invitrogen | D22913 | 10mg/ml, aqueous |
| Alexa Fluor 488 Dextran | Invitrogen | D22910 | 10mg/ml, aqueous |
| Enviro-dri | Shepherd Specialty Papers | www.ssponline.com |
References
- Gillespie, P. G., Muller, U. Mechanotransduction by hair cells: models, molecules, and mechanisms. Cell. 139, 33-44 (2009).
- Bok, J., Chang, W., Wu, D. K. Patterning and morphogenesis of the vertebrate inner ear. Int. J. Dev. Biol. 51, 521-533 (2007).
- Kelley, M. W. Regulation of cell fate in the sensory epithelia of the inner ear. Nat. Rev. Neurosci. 7, 837-849 (2006).
- Ohyama, T. BMP signaling is necessary for patterning the sensory and nonsensory regions of the developing mammalian cochlea. J. Neurosci. 30, 15044-15051 (2010).
- Pan, W., Jin, Y., Stanger, B., Kiernan, A. E. Notch signaling is required for the generation of hair cells and supporting cells in the mammalian inner ear. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 15798-15803 (2010).
- Gubbels, S. P., Woessner, D. W., Mitchell, J. C., Ricci, A. J., Brigande, J. V. Functional auditory hair cells produced in the mammalian cochlea by in utero gene transfer. Nature. 455, 537-541 (2008).
- . . Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. , (2010).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Controlled expression of transgenes introduced by in vivo electroporation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 1027-1032 (2007).
- Chen, C., Smye, S. W., Robinson, M. P., Evans, J. A. Membrane electroporation theories: a review. Med. Biol. Eng. Comput. 44, 5-14 (2006).
- Saito, T. In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system. Nat. Protoc. 1, 1552-1558 (2006).
- Brigande, J. V., Gubbels, S. P., Woessner, D. W., Jungwirth, J. J., Bresee, C. S. Electroporation-mediated gene transfer to the developing mouse inner ear. Methods Mol. Biol. 493, 125-139 (2009).
- Morsli, H., Choo, D., Ryan, A., Johnson, R., Wu, D. K. Development of the mouse inner ear and origin of its sensory organs. J. Neurosci. 18, 3327-3335 (1998).
- Sher, A. E. The embryonic and postnatal development of the inner ear of the mouse. Acta. Otolaryngol. , 1-77 (1971).
- Sheffield, A. M. Viral vector tropism for supporting cells in the developing murine cochlea. Hear Res. 277, 28-36 (2011).
- Bedrosian, J. C. In vivo delivery of recombinant viruses to the fetal murine cochlea: transduction characteristics and long-term effects on auditory function. Mol. Ther. 14, 328-335 (2006).
- Reisinger, E. Probing the functional equivalence of otoferlin and synaptotagmin 1 in exocytosis. J. Neurosci. 31, 4886-4895 (2011).
- Magnani, E., Bartling, L., Hake, S. From Gateway to MultiSite Gateway in one recombination event. BMC Mol. Biol. 7, 46 (2006).
- Perret-Gentil, M. . Principles of Veterinary Suturing. , .
- Oesterle, A. . P-1000 & P-97 Pipette Cookbook. , (2011).
