Denne protokollen beskriver hvordan du utfører celleviabilitet og fluorescens uttrykk analyser med Tali Bilde-Based cytometeret.
Encellede og befolkningen informasjon er vanligvis oppnås enten ved flowcytometri eller fluorescens mikroskopi. Men disse to metodene gir forskjellig informasjon. Flowcytometri gir kvantitative multi-parametriske informasjon om fysiske egenskaper og flekker eller uttrykk, men ikke tillater for visualisering. Stand-alone fluorescens mikroskopi gir visuell data, men ikke tillater for enkel kvantitative målinger 1.
Bilde-baserte cytometri bro mellom disse to metodene, slik at rask visualisering og samtidig kvantitativ analyse av tusenvis av celler i heterogene populasjoner 2. Her presenterer vi en metode for å utføre celleviabilitet og grønt fluorescerende protein (GFP) uttrykk analyser med Tali Bilde-Based cytometeret 3. Den Tali instrument er et 3-kanal (lyse felt, grønn fluorescens, rød fluorescens) Borstemmaskin assay plattform som offers flere fordeler fremfor flow cytometri og fluorescens mikroskopi. Den Tali cytometeret er rimeligere, tar opp mindre benk plass, krever mindre vedlikehold, og arbeidet flow er forenklet slik at drift og analyse er mye enklere og raskere. Den Tali cytometeret er i stand til å utføre en rekke suspensjon celle-baserte analyser, herunder GFP og rødt fluoriserende protein (RFP) uttrykk, apoptose 4-6 og celleviabilitet analyse med propidium jodid (PI) 7-11.
Her demonstrerer vi bruken av Tali instrument i å utføre en celleviabilitet analysen i cellene uttrykker GFP. GFP-transduced celler er farget med Tali Livskraftig Kit – Dead Cell Red. Cellene blir deretter pipetteres til en Tali Cellular Analysis Skyv og lastet inn i cytometeret. Bright feltet, rød fluorescens og grønn fluorescens bildene er tatt og analysert ved analysen spesifikke algoritmer. Histogrammer er da genereres å vise celle størrelse, PI fluorescence intensitet, og GFP-fluorescens intensitet. Disse parametrene kan deretter thresholded å hjem på en bestemt celle befolkning.
En side ved side sammenligning av Tali Bilde-Based cytometeret og tradisjonelle flowcytometri viser at de to metodene gir sammenlignbare data om celleviabilitet og protein uttrykk. Gir imidlertid Tali instrumentet mer visuell informasjon om cellen befolkningen som ikke kan oppnås ved hjelp av en strømningscytometer.
Vi har nettopp detaljert en prosedyre for å utføre levedyktighet teller og vurdere GFP uttrykk med Tali Bilde-Based cytometeret. Bruk samme fremgangsmåte, er dette cytometer stand til å utføre en rekke andre tester, inkludert: apoptose, RFP og celleviabilitet analyse ved hjelp av non-transduced celler.
Fluorometric analyser av celle levedyktighet, genuttrykk og apoptose har blitt viktige metoder i biomedisinsk forskning 7-12. I det siste, separate instrumentering har blitt brukt til å innhente kvantitative og visuell informasjon om celler. Mens kvantitativ informasjon om celler i en heterogen befolkning har blitt høstet gjennom bruk av flowcytometri, har visuell eller kvalitativ informasjon er innhentet gjennom bruk av fluorescens mikroskopi 1-4. Her presenterer vi en teknologi som bygger bro mellom befolkningen og enkelt celle studier. Bruke Tali Bilde-Based cytometer, kvantitative daTA og visuell celle data om individuelle celler eller celle populasjoner kan samles samtidig. Den Tali Instrumentet kan brukes for en rekke programmer, inkludert vurdering av genekspresjon, apoptose analyser, studier av legemidlets effekt, og vurdering av sykdomsprogresjon.
Den Tali Bilde-Based cytometeret fanger opp og analyserer lyse-feltet, rød fluorescens og grønn fluorescens bilder, slik at informasjon om subpopulasjoner av celler som skal innhentes. For eksempel i denne analysen, var vi i stand til å skille døde celler fra levende celler i GFP-uttrykke celle befolkningen bruker Død Cell rødt fargestoff. Dette gir nøyaktighet i måling av levedyktige celler uttrykker GFP, og identifiserer befolkningen i cellene brukbar for nedstrøms behandling. Det er viktig å merke seg at de døde cellene i befolkningen kan oppstå fra forskjellige kilder, inkludert normal celledød i kultur eller celledød forårsaket av miljømessige forhold (f.eks trypsinization eller deATH indusert av transfeksjon / transduksjon metoden som velges).
Her skal vi demonstrere bruken av Tali cytometeret med U2OS celler. Lignende metoder kan utføres ved hjelp fleste pattedyrs og insekt celler. For hver celle linje, produsert Tali cytometeret kvantitative GFP uttrykket data, som ikke er mulig med en visuell inspeksjon av cellene ved hjelp av en standard fluorescens mikroskop. Selv om disse resultatene er sammenlignbare med flowcytometri, de er samlet i en brøkdel av tiden. Cytometeret er i stand til nøyaktig telle celler mellom 5 mikrometer til 60 mikrometer i diameter, ideelt i en konsentrasjon på 1 x 10 5 til 1 x 10 7 celler / ml.
Det er viktig å påpeke at de fleste standard flekker protokoller, inkludert the Dead Cell Røde flekker protokoll som beskrives her, bruk propidium jodid å skille levende og døde celler. Dette er en utfordring ved vurdering av levedyktighet i celler som har blitt permeabilized for staining av intracellulære markører, siden PI vil farge som helst celle med en kompromittert membran. Siden noen fluorescerende fargestoff eller protein som kan oppdages med det grønne eller røde fluorescens kanaler kan analyseres på Tali Bilde-Based cytometer, kan fremtidige studier undersøke bruk av alternative fargestoffer, slik som amin reaktive levedyktighet fargestoffer fire. En studie fra 2006 av Perfetto et al. 12 fant disse fargestoffer å være enkel å bruke og reproduserbar i diskriminerende levende og døde celler populasjoner.
Merk at Tali har begrensninger med hensyn til hvilke typer analyser det kan utføre. For eksempel, siden målet brukes av instrumentet er 4X, regner operasjoner begrenset til større celletyper: sub-cellulære strukturer som mitokondrier eller blemmer, og bakterieceller kan ikke kvantifiseres. Også oppmerksom på at påvisning kanalene i Tali er begrenset til fluorophores som vil opphisse og avgir innen kanalene. Mens YFP og lyse mCherry signaler cen bli oppdaget, dimmer mCherry signalene ikke kan. Til slutt analyserer Tali eneste celler i suspensjon. Det vil ikke nøyaktig telle celler fester seg til et lysbilde. Videre, mens det er kun begrenset mulighet for å telle celler som er uregelmessig formet, inkludert noen gjær og primære celler.
I tillegg vil fremtidige studier sannsynlig adresse bruken av dette systemet i å vurdere uttrykket av intracellulære markører. Individuelle fargestoffer kan kontrolleres for spektral overlapp med tilstøtende kanaler, ved hjelp av Invitrogen er online SpectraViewer verktøyet ( www.invitrogen.com / spectraviewer ). Gitt newness av denne teknologien, har hele spekteret av applikasjoner ennå ikke er oppdaget.
I sammendraget, de Tali bilde-Based cytometeret demonstrert her presenterer en ny teknologi som gjør det mulig for samtidig visualisering og analyse av celle populasjoner, slik at vurdering av individuelle celler samt cell populasjoner i et kompakt format med en enkel arbeidsflyt.
The authors have nothing to disclose.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
Tali Image-Based Cytometer | Invitrogen | T10796 |
Tali Cellular Analysis Slides, 50 Slides | Invitrogen | T10794 |
Tali Cellular Analysis Slides, 500 slides | Invitrogen | T10795 |
Tali Viability Kit – Dead Cell Red | Invitrogen | A10786 |
Tali Viability Kit – Dead Cell Green | Invitrogen | A10787 |
Tali Apoptosis Kit | Invitrogen | A10788 |
U2OS cells |