चूहा जिगर से पोर्टल fibroblasts अलग करने के लिए एक तकनीक वर्णित है. यकृत perfused कर रहे हैं और पचा<em> बगल में</em> Collagenase के साथ, द्वारा पीछा<em> पूर्व vivo</em> जिगर गारा और कोशिकाओं के आकार के चयन के पाचन. इस विधि संस्कृति में पारित होने के लिए आवश्यकता के बिना पोर्टल fibroblasts की एक शुद्ध आबादी प्रदान करता है.
जिगर तंतुमयता से सक्रिय myofibroblasts के बाह्य मैट्रिक्स के अत्यधिक बयान से परिभाषित किया गया है. यकृत myofibroblasts यकृत तारामय कोशिकाओं, पोर्टल fibroblasts और अस्थि मज्जा व्युत्पन्न fibroblasts 1 सहित कई व्यापारियों, कर रहे हैं. यकृत तारामय कोशिकाओं सबसे अच्छा अध्ययन किया गया है, लेकिन पोर्टल fibroblasts myofibroblast पूल में महत्वपूर्ण योगदान के रूप में तेजी से मान्यता प्राप्त कर रहे हैं, विशेष रूप से पित्त 2 तंतुमयता में. पोर्टल के विषय में fibroblasts पित्त उपकला चोट के जवाब में प्रसार से गुजरना, संभवतः पित्त 3-5 scarring के प्रारंभिक चरणों में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा रहा है. पोर्टल fibroblasts को अलग करने की एक विधि इस सेल की आबादी के इन विट्रो अध्ययन में अनुमति और भूमिका पोर्टल fibroblasts पित्त फाइब्रोसिस में खेलने का अधिक से अधिक समझने के लिए नेतृत्व होगा.
पोर्टल fibroblasts 6 परिणाम, 7 और ली सहित विभिन्न तकनीकों का उपयोग कर पृथक किया गया हैएंजाइमी आकार 8 चयन के बाद पाचन के साथ देखें छिड़काव. पाचन और परिणाम तकनीक की तुलना में आकार चयन तकनीक का लाभ यह है कि सेल संस्कृति में पारित होने की आवश्यकता के बिना अध्ययन किया जा सकता है. यहाँ, हम मूल चूहा जिगर से पोर्टल fibroblasts कि प्राथमिक कोशिकाओं की एक अपेक्षाकृत शुद्ध जनसंख्या में परिणाम के अलगाव लिए Kruglov और 8 Dranoff के द्वारा वर्णित तकनीक का एक संशोधित संस्करण का वर्णन करता है.
पोर्टल के विषय के fibroblasts पित्त फाइब्रोसिस में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं. यहाँ हम मूल चूहा जिगर से पोर्टल fibroblasts अलग, इन विट्रो में इस सेल की आबादी का अध्ययन करने के लिए एक सीधा रास्ता प्रदान करने के लिए Kruglov और 8 Dranoff में प्रकाशित प्रोटोकॉल के एक संशोधन का वर्णन.
इस दृष्टिकोण प्रोटीज पाचन और आकार के आधार पर निस्पंदन का उपयोग करता है. विधि का प्राथमिक लाभ यह है कि कोशिकाओं की एक अपेक्षाकृत शुद्ध जनसंख्या संस्कृति में पारित होने के बिना प्राप्त किया जा सकता है, जीन अभिव्यक्ति या अलगाव के बाद कई दिनों कार्यात्मक सेल व्यवहार के अध्ययन को सक्षम करने. इस तकनीक को भी दोनों स्वस्थ और रोगग्रस्त यकृत से कोशिकाओं को अलग करने के लिए क्षमता प्रदान करता है.
इस प्रोटोकॉल में सबसे महत्वपूर्ण कदम के यकृत पैरेन्काइमा के enzymatic पाचन है. सफल पाचन सुनिश्चित करने के लिए, यह महत्वपूर्ण है प्रारंभिक perfu के दौरान पुष्टि है कि रक्त पूरी तरह से जिगर के बाहर सूखायकीन है कि वहाँ भी जिगर की blanching द्वारा सायन. इस सुविधा के लिए, यह संभव है एक कपास झाड़ू का उपयोग करने के लिए धीरे से यकृत की मालिश जबकि perfusing. व्यवहार्य कोशिकाओं की कम उपज में जिगर पैरेन्काइमा परिणाम की पाचन, जबकि तहत पाचन पित्त पेड़ से जिगर पैरेन्काइमा को अलग करने के लिए मुश्किल कर देगा. चूंकि pronase की तैयारी अलग बहुत, प्रयोग किया जाता राशि के अनुकूलन के बीच enzymatic गतिविधि में परिवर्तनशीलता है जब वहाँ व्यवहार्य कोशिकाओं की कम उपज है की जरूरत हो सकती है.
इस प्रोटोकॉल एक छोटे गेज चतुर्थ कैथेटर का उपयोग पोर्टल शिरा cannulate द्वारा माउस जिगर या युवा चूहा जिगर से पोर्टल fibroblasts, अलग पशु वजन के अनुपात में छिड़काव समाधान की मात्रा कम है, और लगभग 10 से जिगर छिड़काव की दर कम करने के लिए संशोधित किया जा सकता है / एमएल मिनट.
संस्कृति में पोर्टल fibroblasts 10-14 दिनों में myofibroblastic भेदभाव से गुजरना है, के रूप में α-SMA के पूर्व के द्वारा evidenced9 अभिव्यक्ति. विभिन्न मार्करों यकृत तारामय कोशिकाओं fibulin-2, आईएल -6, elastin, से पोर्टल fibroblasts भेद करने के लिए इस्तेमाल किया गया है न्यूक्लीओसाइड diphosphohydrolase 2 – (NTPDase2) triphosphate, cofilin की 1 और 2 synaptophysin, 6, 10, 11 के रूप में neuronal प्रोटीन . हमने पाया है elastin कि पोर्टल fibroblasts के लिए एक अच्छा मार्कर है, myofibroblastic भेदभाव के बाद भी, जबकि NTPDase2 के बाद पोर्टल fibroblasts कई 9 दिनों के बाद संस्कृति आया है खो दिया है. इसलिए, हम आम तौर पर elastin के लिए immunofluorescence धुंधला द्वारा पोर्टल fibroblasts की अलगाव की पुष्टि.
इस तकनीक की सीमा यह है कि, पोर्टल तंतुप्रसू अलगाव के तुरंत बाद, Kupffer कोशिकाओं और पित्त कोशिकाओं सहित कोशिकाओं contaminating के एक छोटा सा अंश है. पोर्टल fibroblasts 2-3 दिनों के भीतर इन contaminating के कोशिकाओं को विकसित हो जाना, लेकिन जाएगा, एक अपेक्षाकृत शुद्ध (> 98%) आबादी 9 उपज.
सीnce संस्कृति में पोर्टल fibroblasts टिशू कल्चर प्लास्टिक पर myofibroblastic भेदभाव से गुजरना है, हम आम तौर पर अलगाव के 7 दिनों के भीतर इन कोशिकाओं का अध्ययन. कोशिकाओं के 10% भ्रूण गोजातीय सीरम युक्त पोर्टल fibroblast संस्कृति मीडिया में रखा जाता है, के रूप में तरीकों खंड में वर्णित है. हालांकि, इन कोशिकाओं के विकास मीडिया में कई दिनों के लिए 2% से भ्रूण गोजातीय सीरम युक्त बच जाएगा. हम आम तौर पर कम सीरम मीडिया के अलगाव के बाद कम से कम 24 घंटे तक प्रयोग नहीं करते. एक बार पोर्टल fibroblasts myofibroblastic भेदभाव से गुजरना, वे कई बार passaged किया जा सकता है और myofibroblasts के जमे हुए स्टॉक के रूप में रखा.
The authors have nothing to disclose.
यह काम में R01 एनआईएच DK05823 (RGW के लिए), DK083213 F32 (JWW के लिए), DK081265 F30 (ALO करने के लिए), और फ्रेड और थीं Biesecker बाल यकृत केन्द्र (RGW के लिए) से एक अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया था.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
Type 2 Collagenase | Worthington Biochemical (Lakewood, NJ) | LS004177 |
Pronase | Roche (Indianapolis, IN) | 70290120 |
Hyaluronidase | Sigma (St. Louis, MO) | H3506 |
Deoxyribonuclease | Sigma | D4527 |
DMEM/F12 | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 11320 |
HBSS without Ca2+/Mg2+ | Mediatech (Manassas, VA) | 21-021-CM |
HBSS with Ca2+/Mg2+ | Mediatech | 21-020-CM |
Leibovitz’s L-15 | Invitrogen | 11415 |
RPMI Medium 1640 | Invitrogen | 11875 |
Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 |
Fetal Bovine Serum | Gemini Bio (West Sacramento, CA) | 900-108 |
Nitex Nylon Mesh 30 μm | Genesee Scientific (San Diego, CA) | 57-105 |