Un Ex vivo se describe para el aislamiento de las arteriolas de resistencia del músculo gracilis más grandes para los interrogatorios tanto de las respuestas vasculares a los estímulos vasoactivos y la evaluación de las propiedades básicas estructurales a través de la mecánica de la pared pasivos.
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Artículo de método
La Ex vivo Preparación aislada Microvessel esquelético para la Investigación de la reactividad vascular
En este artículo
Resumen
Resumen
La preparación microvasos aislado es una preparación ex vivo, que permite el examen de las contribuciones de diferentes factores que diámetro de control del buque, y por lo tanto, la resistencia a la perfusión 1-5. Esta es una preparación clásica experimental que fue, en gran medida, descrita inicialmente por Uchida et al. 15 hace varias décadas. Esta descripción inicial sirvió de base para las técnicas que se ha modificado y mejorado ampliamente, principalmente en el laboratorio del Dr. Brian Duling en la Universidad de Virginia, 6-8, y se presenta un enfoque actual en las páginas siguientes. Esta preparación se referirá específicamente a la arteriola gracilis en una rata como la microvasos de elección, pero la preparación de base pueden aplicarse fácilmente a los buques aisladas a partir de casi cualquier otro tejido u órgano a través de especies 9-13. Mecánica (es decir, dimensiones) cambios en la microvasculatura aislado puede ser evaluado fácilmenteen respuesta a una amplia gama de fisiológico (por ejemplo, presión hipoxia, intravascular, o cizallamiento) o retos farmacológicos, y puede dar una idea de elementos mecánicos que comprenden las respuestas integradas en una intacta, aunque ex vivo, el tejido. La importancia de este método es que permite la fácil manipulación de las influencias sobre la regulación integrada del diámetro de los microvasos, mientras que también permite el control de muchas de las contribuciones de otras fuentes, incluyendo la presión intravascular (miogénica), inervación autónoma, hemodinámica ( por ejemplo, el esfuerzo cortante), estímulos endoteliales dependientes o independientes, hormonales e influencias del parénquima, para proporcionar una lista parcial. Bajo condiciones experimentales adecuadas y con objetivos adecuados, esto puede servir como una ventaja sobre in vivo o in situ tejido / órgano preparaciones, que no permiten fácilmente para el control fácil de amplios variables sistémicas.
La maJor limitación de esta preparación es básicamente la consecuencia de sus puntos fuertes. Por definición, el comportamiento de estos buques se está estudiando en condiciones en muchos de los que más contribuyen a la regulación de la resistencia vascular se han eliminado, incluso neuronales, humorales, metabólicas, etc Por lo tanto, el investigador recibe una tarjeta amarilla para evitar la sobre- interpretación y extrapolación de los datos que se recogen la utilización de esta preparación. La otra área importante de preocupación con respecto a esta preparación es que puede ser muy fácil de dañar los componentes celulares, tales como el revestimiento endotelial o el músculo liso vascular, de tal manera que la fuente variable de error puede ser introducido. Se recomienda encarecidamente que el investigador individual utilizan las medidas apropiadas para garantizar la calidad de la preparación, tanto en el inicio del experimento y periódicamente durante el curso de un protocolo.
Protocolo
1. Antes del experimento
- Antes del día experimento, los tubos capilares de vidrio de las dimensiones apropiadas para la estación se ven involucrados en micropipetas (ya sea un extractor horizontal o vertical, se puede utilizar). El diámetro de la punta puede ser fácilmente ajustado en función del vaso que se está aislado, aunque por lo general utilizar un rango de diámetro entre 50-150 micras. Estos son luego dobladas a la configuración apropiada para el calentamiento estación siguiente microvasos sobre una llama de butano. Puntas de micropipeta están físicamente roto con el diámetro aproximado (con unas pinzas finas) para el microvasos en cuestión y puede....
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Discusión
El protocolo presentado describe la canulación de aislamiento, la eliminación y de un doble microvasos del músculo esquelético, aunque esta técnica general puede aplicarse fácilmente a la mayoría de los tejidos. Para el manuscrito actual, el término "arteriola" ha sido utilizado por los autores para describir a un buque de la resistencia que oscila entre 70-120 micras de diámetro, bajo tono activo de reposo, que es también una importante contribución a la regulación de la resistencia a la perfusión de un órgan.......
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Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por la American Heart Association (EIA 0740129N) y NIH HL90610 T32.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Reactivos y Equipos | Empresa | Comentarios / Catálogo # | |
| Buque Cámara | Costumbre | David Eick (MCW) | |
| Baño caliente de recirculación de agua | PolyScience y Haake | Haake DC 10 | |
| Pipetas | Federico Haer & Co. | Tubo capilar de 2,0 mm x 1,0 mm de diámetro externo de identificación (27-33-1) | |
| Monitor de presión | World Precision Instruments | ||
| Camisa de agua depósito | Costumbre | ||
| Fuente de luz externa | World Precision Instruments | Novaflex | |
| Pipetear Extractor | Microdatos de Instrumentos | PMP102 Micropipeta Extractor | |
| Complementa completadesarrollo de herramientas quirúrgicas | Herramientas de Bellas Ciencia | Dumont | |
| Ultra unas pinzas finas | Herramientas de Bellas Ciencia | Inox # 5 | |
| Seda hilo de sutura | Ethilon | # 10-0 o 9-0 | |
| Microscopio estéreo | Olimpo | Olympus SZ-11 | |
| Calibres de vídeo analógico | Boeckeler | A través del controlador (Via-100) | |
| Cámara analógica de alta resolución | Panasonic | GP-MF 602 | |
| Tanque de Oxígeno | Regional | 21% el balance de nitrógeno y un 5% de CO 2 el balance de nitrógeno | |
| Tubería | Tygon | ||
| Drene la bomba | Cole Parmer Instrument Co. | ||
| Modificados PSS Rata | Ver receta a continuación | ||
| PSS Relajante van Breemen de | Ver receta a continuación |
Tabla 1. Una lista de los principales componentes de la instalación aislada estación de microvasos se presenta en las figuras.
| Rata Modificado Receta PSS | Para hacer dos litros de PSS | 20X sal para el ganado (2L) | 20X Reserva de Estabilización (2L) |
|---|---|---|---|
| NaCl | 278,0 g | ||
| KCl | 14,0 g | ||
| MgSO 4-7H 2 O | 11,5 g | ||
| CaCl 2-H 2 O | 9,4 g | ||
| NaHCO3 | 80,8 g | ||
| EDTA | 0,4 g | ||
| NaH 2 PO 4 | 0,28 g | ||
| Glucosa | 1,98 g | ||
| 20x sal para el ganado | 100 ml | ||
| 20x Reserva de Estabilización | 100 ml | ||
| Agua destilada | 1800 ml |
Tabla 2. Composición de la solución estándar salina fisiológica (PSS) utilizado en los protocolos microvasos aislados.
Comentarios sobre receta: Hacer 2 l de caldo de sal y 2 litros de reserva de estabilización. Estos cun ser refrigerado cuando no se utilicen, pero agite bien y con frecuencia antes de la preparación de PSS. Los ingredientes adicionales se añaden en el momento de la preparación de PSS finales.
| PSS Relajante van Breemen de | Para hacer 2 litros de PSS | 20X sal para el ganado (1 litro) | 20X Reserva de Estabilización (1L) |
|---|---|---|---|
| NaCl | 107,4 g | ||
| KCl | 7,0 g | ||
| MgSO 4-7H 2 O | 5,76 g | ||
| MgCl 2-6H 2 O | 81,32 g | ||
| NaHCO $ 3 | 40,4 g | ||
| EDTA | 0,2 g | ||
| EGTA | 15,22 | ||
| NaH 2 PO 4 | 0,28 g | ||
| Glucosa | 1,98 g | ||
| 20x sal para el ganado | 100 ml | ||
| 20x Reserva de Estabilización | 100 ml | ||
| Agua destilada | 1800 ml |
Tabla 3. Receta para relajante Van Breemen de solución salina fisiológica (PSS) utilizado en los protocolos microvasos aislados bajo condiciones de tono activo cero.
Comentarios sobre receta: Hacer 1 l de caldo de salº 1 L de la Reserva de Estabilización. Estos pueden ser refrigerado cuando no se utilicen, pero agite bien y con frecuencia antes de la preparación de PSS. Los ingredientes adicionales se añaden en el momento de la preparación de finales PSS relajantes.
Referencias
- Goodwill, A. G., Frisbee, S. J., Stapleton, P. A., James, M. E., Frisbee, J. C. Impact of Chronic Anticholesterol Therapy on Development of Microvascular Rarefaction in the Metabolic Syndrome. Microcirculation. , 1-18 (2009).
- Goodwill, A. G., James, M. E., Frisbee, J. C.
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