Den<em> Drosophila</em> Æg kammeret er en fremragende model til undersøgelse af de mekanismer af mRNA lokalisering. For at fange de dynamiske begivenheder, der danner grundlag for lokalisering, er hurtig høj opløsning billeddannelse af levende væv påkrævet. Her præsenterer vi en protokol for dissektion og billedbehandling af levende prøver med minimal forstyrrelse.
Levende celler billeddannelse er en vigtig teknik anvendes på en række Drosophila væv, der anvendes som modeller til at undersøge emner såsom akse specifikation, celledifferentiering og organogenese 1. Korrekt forberedelse af de eksperimentelle prøver er en vigtig, ofte overset, trin. Målet for præparat er at sikre fysiologiske relevans og etablere optimale billeddannelse betingelser. For at opretholde vævslevedygtighed, er det vigtigt at undgå dehydrering, hypoxi, overophedning eller medium forringelse 2.
Den Drosophila æg Kammeret er et veletableret system for behandlingen af spørgsmål vedrørende, men ikke begrænset til kroppen mønster, mRNA lokalisering og cytoskeletal organisation 3,4. For tidlig-og midt-fase æg kamre, er stigende i Halocarbon oil god for at overleve i, at det tillader fri diffusion af ilt, forhindrer dehydrering og hypoxi og har fremragende optiske egenskaber til mikroskopi. Imældning af fluorescerende proteiner er mulig ved at indføre transgener ind i ægget kammer eller fysisk injektion af mærket RNA, protein eller antistoffer 5-7. For eksempel kan tilsætning af MS2-konstruktioner til genomet af dyr tidstro overvågning af mRNA'er i oocytten 8. Disse konstruktioner muliggør in vivo mærkning af mRNA ved anvendelse af MS2 bakteriofag RNA-stilken sløjfe interaktion med kappeprotein 9.
Her præsenterer vi en protokol til udvinding af æggestokkene samt isolering af individuelle ovarioles og æg kamre fra den kvindelige Drosophila. For en detaljeret beskrivelse af Drosophila oogenesen See Allan C. Spradling (1993, genoptrykt 2009) 10.
Levende celler billeddannelse er en kraftig assay for behandlingen cellulære processer, i realtid. Ud over simple lys felt observation, har tilsætning af fluorescerende mærker til proteiner og RNA'er af interesse fører til mange gennembrud. Her har vi beskrevet en protokol for billeddannelse individuelle levende oocytter, som kan anvendes i kombination med genetiske og biokemiske assays.
I denne protokol, vi også forklare, hvordan man eksperimentelt manipulere levende oocytter ved injektion. Der er mange muligheder for materiale til injektion, herunder in vitro syntetiseret fluorescerende mærkede RNA til analyse af evnen af en sekundær struktur til direkte RNA lokalisering (Ball og Davis, upubliceret), og antistoffer, der inhiberer funktionen af proteiner 6. Det fremtidige arbejde vil sandsynligvis se indførelsen af andre mærkningskrav komponenter og cellulære maskineri til levende oocyter gør det muligt for molekylære mekanismer, der skal testes.
t "> Bevarelse af levedygtighed og sundhed vævet er afgørende, når man arbejder med levende celler. I denne protokol, peger vi på en række skridt, der kan føre til stress af ægget kammeret. For eksempel, på trods af olie er overlegen til billedbehandling, Udvidet kultur i olien kan føre til stress på ægget kammeret. Dette kan nemt overvåges under lyse felteksponering ved at undersøge det nukleare morfologi og placering, oocyt membran, der vil fordreje og bleb under stress (sammenlign figur 7E (ustressede) til Figure7F ( understreget)). Stage 9 æg kamre vise RNA lokalisering og grænsen cellemigration 12 over flere timer. Men en scene 7/8 æg kammer vil begynde at udvise skadelige virkninger i Halo kul olie efter omkring 40 minutter i æggestokkene blive fjernet fra kvindelige. sent æg kamre, trin 11 til 14, kan udvikle sig normalt i enten olie eller vandige medium på grund af udskillelse af æggeskallen fra follikelceller på disse stadier 13. Det har været reported at tilsætningen af insulin til vandig insekt medium kan opretholde scene 9 oocytter i op til 6 timer 14 og germaria op til 14 timer 15. I alle tilfælde bør aggressiv manøvrering af ægget kammeret undgås, da det understreger de oocytter og reducerer dens levedygtighed. Imaging færre æg kamre og tage sig til at behandle hver enkelt forsigtigt er den bedste måde at sikre optimal levedygtighed.The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af en Wellcome Trust Senior Research Fellowship til I. Davis.
Tools used in dissection should be clean but do not need to be autoclaved. Wipe tools with ETOH and allow them to dry before beginning.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Fine tipped paint brush (Artists Sable, round, size 00 or 0) |
Available from most art supplies outlets | A good quality brush is important | |
Halocarbon Products Corporation, Series 95 | Halocarbon Products Corporation, 887 Kinderkamack Road, River Edge NJ 07661 | European distributor: Solvadis (GMBH) Be sure to oxygenate by bubbling air through the oil. |
|
Cover slip -No. 1.5, 22 x 50mm | International- No1-VWR Cat=631-0137-22-50mm | Menzel-Glaser-22-40mm-MNJ 400-070T | |
Dumont No.5 – Dumostar | Fine Science Tools | 11253-20 | “Biologie” tip is also good but more fragile |
Dissecting probe | Fine Science Tools | 10140-01 | |
Dissecting microscope | Olympus | SZ61 | |
CO2 pad | Available through http://www.flystuff.com/ (A division of Genesee Scientific) |
59-114 (789060 Dutscher) |
European distributor: Dutscher www.dutscherscientific.com/ It is also relatively easy to custom build your own fly pads |
KimCare | Kimbery Clark-KimCare-Medical wipes | KLEW3020 | |
Microscope- DeltaVision | Applied Precision | DC-CORE | |
Micromanipulator | Burleigh Micromanipulators from Lumen Dynamics Group inc. 2260 Argentia Road, Mississauga, Ontario, L5N 6H7 Canada |
Burleigh PCS-5000 series, TS-5000-300 | http://www.ldgi-burleigh.com/ (Formerly Exfo) |
Injection apparatus | Tritech Research, Inc. 2961 Veteran Ave Los Angeles, CA 90064 |
MINJ-1 | Modified with a holder to take Eppendorf Femptotips |
Injection needle | Eppendorf Sterile Femtotips I and II | 930000043 | Different tips are better for different applications |
Loading tips 20μl | Eppendorf | 5242956.003 | |
Dry active yeast | Fleischmann’s Yeast | #2192 |