Transgene mus har vært svært nyttig i tillegge fysiologiske funksjon til gener. Som sådan, forskning generelt, og funksjonelle studier av luftveier, spesielt, har gjennomgått en bemerkelsesverdig forskyvning mot murine modeller. Her gir vi protokoller for<em> In vitro</em> Trachea innsnevring studier for å evaluere glatt muskel funksjon i murine luftveier.
Transgene og knockout mus har vært kraftige verktøy for etterforskningen av fysiologi og patofysiologi av luftveiene 1,2. In vitro tensometry av isolerte tracheal preparater har vist seg å være en nyttig analyse av luftveiene glatt muskulatur (ASM) kontraktile respons på genmodifiserte mus. Disse in vitro tracheal preparater er relativt enkel, gir en robust respons, og beholde både funksjonelle kolinerge nerveender og muskel respons, selv etter lang Inkuberinger.
Tracheal tensometry gir også en funksjonell analyse for å studere en rekke andre messenger signalveier som påvirker sammentrekning av glatt muskulatur. Sammentrekning i luftrøret er hovedsakelig mediert av parasympatiske og kolinerge nerver som utløser acetylkolin på ASM (figur 1). De store ASM acetylkolinreseptorer er muskarin M2 og M3 som er G i / o og GQ koblede reseptorer, henholdsvis <sup> 3,4,5. M3 reseptorer fremkalle sammentrekning av kopling til GQ å aktivere fosfolipase C, øker IP3 produksjon og IP3-mediert kalsium utgivelse fra sarcoplasmic retikulum 3,6,7. M2 / G i / o signalisering antas å øke sammentrekninger ved hemming av adenylat cyclase fører til en nedgang i Camp nivåer 5,8,9,10. Disse banene utgjør den såkalte "farmako-sammentrekning kobling" av luftveiene glatt muskulatur 11. I tillegg innebærer kolinerge signalering gjennom M2 reseptorer (og modulert av M3 signalering) veier som depolarize ASM som igjen aktiverer L-type, spenning-kalsiumkanaler (figur 1) og kalsium tilstrømning (såkalt «eksitasjon-kontraksjon kopling" ) 4,7. Mer detaljerte vurderinger på signalveier som styrer Airway innsnevring kan bli funnet 4,12. Ovennevnte stier ser ut til å bli konservert mellom mus og andre arter. Men mus tracheas skiller seg fra andre arter in noen signalveier. Mest fremtredende er deres mangel på kontraktile respons på histamin og adenosin 13,14, begge velkjente ASM modulatorer i mennesker og andre arter 5,15.
Her presenterer vi protokoller for isolering av murine tracheal ringer og in vitro måling av deres kontraktile utgang. Inkludert er beskrivelser av utstyret konfigurasjonen, luftrøret ring isolasjon og kontraktile målinger. Eksempler er gitt for fremkaller sammentrekninger indirekte ved hjelp av høy kalium stimulering av nerver og direkte ved depolarisering av ASM muskler for å aktivere spenning avhengig kalsium innstrømning (1. Høy K +, Figur 1). I tillegg er metodene som presenteres for stimuleringer av nerver alene ved hjelp av elektrisk felt stimulering (to. EFS, figur 1), eller for direkte stimulering av ASM muskel bruker eksogene nevrotransmitter brukes på bad (3. Eksogene ACH, en figur). Dette FLExibility og enkel tilberedning gjør det isolerte luftrøret ringen modell en robust og funksjonell analyse for en rekke av signalanlegg kaskader involvert i luftveiene glatt muskel sammentrekning.
Protokollen presenteres her gir en fysiologisk forberedelse til å vurdere luftveier muskelfunksjon. Vi generelt opererer 3-4 orgel bad preparater samtidig, men prepackaged systemer er tilgjengelig fra en rekke leverandører som tillater samtidige målinger på opp til 8 preparater (ADInstruments, World presisjonsinstrumenter, og Harvard Apparater). Vi har benyttet en rekke force transdusere og vev orgel bad med tilsvarende resultater. Men finner vi at elektrisk felt stimulering gir litt variasjon basert på små forskj…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble finansiert av en bevilgning fra Senter for Innovasjon i forebygging og behandling av luftveissykdommer og NINDS Grant (NS052574), og fra Sandler Program for Astma Research.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Analogue-Digital Converter | ADInstruments | PowerLab 4/35 | |
Carbachol (Carbamoylcholine Chloride) | Sigma-Aldrich | C4832 | 10-2 M in water (aliquots can be stored at -20°C) |
Charting Software | ADInstrtuments | LabChart | |
Heating Circulator | Haake | Mixer Mill MM400 | |
Isometric Force Transducer | Kent Scientific | TRN001 | |
Stimulator | Grass Technologies | S88 Dual Output Square Pulse Stimulator | |
Tissue Bath | WPI | 47264 |