Aquí demostramos nuestro protocolo de aislamiento de las células de los conductos glandulares basales y submucosa de tráqueas de ratón. También se demuestra el método de la inyección de células madre en la alfombrilla del ratón grasa dorsal para crear un In vivo Modelo de regeneración glándula submucosa.
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Artículo de método
Aislamiento de células basales y de células submucosas conducto de la glándula de ratón tráquea
En este artículo
Resumen
Resumen
Las vías respiratorias están directamente en contacto con el medio ambiente y por lo tanto susceptibles a las lesiones de las toxinas y agentes infecciosos que se respira en 1. Las vías respiratorias grande por lo que requieren un mecanismo de reparación eficaz para proteger a nuestros cuerpos. Este proceso de reparación se produce a partir de células madre en las vías respiratorias y el aislamiento de estas células madre de las vías respiratorias es importante para la comprensión de los mecanismos de reparación y regeneración. También es importante para la comprensión de reparación anormal que puede conducir a enfermedades de las vías 2. El objetivo de este método consiste en aislar una población de células madre de ratón novela de los conductos de las glándulas submucosas traqueales y para colocar estas células in vitro y en modelos de sistemas in vivo para identificar los mecanismos de reparación y regeneración de las glándulas submucosas 3. Esta producción muestra métodos que pueden ser utilizados para aislar y ensayo de las células madre del conducto y basal de la gran vías respiratorias 3. Esto nos permitirápara estudiar las enfermedades de las vías respiratorias, tales como la fibrosis quística, el asma y la enfermedad pulmonar obstructiva crónica. En la actualidad, no existen métodos para el aislamiento de células de las glándulas submucosas y conductos no hay modelos in vivo para estudiar la regeneración de las glándulas submucosas.
Protocolo
Esquema de los pasos
1. La disección de la tráquea
2. Limpieza de la tráquea y se corta
3. Enzima digestión y el tratamiento en suspensión de células individuales
4. La tinción de FACS y clasificación
5. Procesamiento de células clasificadas para in vivo e in vitro modelos
1. La disección de la tráquea
- Sacrificar al ratón con una inyección intraperitoneal de 0,1 cc mg/0.2 de pentobarbital.
- Cortar abrir la pared abdominal, y mover los intestinos al lateral para ....
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Discusión
Esta técnica para aislar células de los conductos y basal de las vías respiratorias es importante para mejorar nuestra comprensión de la reparación de las vías respiratorias y las enfermedades de las vías respiratorias y regeneración. Las técnicas descritas aquí son algunas medidas críticas. El primero es el período optimizado digestión enzimática. La segunda es la creación de una única suspensión celular a través de pasada en serie con agujas de calibre progresivamente más altas para prevenir la rotura de células, pero.......
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Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Agradecimientos
Nos gustaría reconocer el amplio FACS de células madre del Centro de Investigación y sobre todo gracias a Jessica Scholes y Codrea Felicia por su ayuda con la clasificación de células. El trabajo fue financiado por el CIRM RN2-00904-1, K08 HL074229, American Thoracic Society / COPD Foundation ATS-06-065, La Fundación preocupación, la UCLA Jonsson Comprehensive Cancer Center Thoracic Oncology Program / SPORE pulmón Cáncer, la Universidad de California del Cáncer Investigación Comité de Coordinación y el Gwynne Hazen cereza Memorial Laboratories (BG).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Nombre del reactivo | Empresa | El número de catálogo | |
| Medio completo 10: DMEM-F-12, 50/50, 1X) | Mediatech | 15 a 090-CV | |
| Hepes (15 mM) | Invitrogen | 15630 | |
| Bicarbonato de sodio (3,6 mm o 0,03%) | Invitrogen | 25080 | |
| L-glutamina (4 mM) | Mediatech | 25-005-Cl | |
| Penicilina (100 U / ml) | Mediatech | 30 a 001-CI | |
| Estreptomicina (100 mg / m) | Mediatech | 30 a 001-CI | |
| La anfotericina B (0,25 g / ml) | Lonza | 17-836R | |
| Eninsulina (10 mg / ml) | Sigma | I6634 | |
| Transferrina (5 mg / ml) | Sigma | T1147 | |
| La toxina del cólera (0,1 g / ml) | Sigma | C8052 | |
| Factor de crecimiento epidérmico (25 ng / ml) | BD | 354001 | |
| Extracto de pituitaria bovina (30 mg / ml) | Invitrogen | 13028-014 | |
| Suero bovino fetal (5%) | Pescador | SH3008803HI | |
| El ácido retinoico (0,05 mM) | Sigma | R2625 | |
| Factor de crecimiento reducido Matrigel | BD | 354230 |
Tabla 1. Completar componentes de medios.
| Nombre del reactivo | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Pronasa | Roche | 10165921001 | Utilizado en un 0,15%: -O / N a 4 ° C para aislar la digestión total de células de la tráquea (para cultivo ALI) -4 Digestión hr 4 ° C para aislar SMG |
| Dispasa | BD Biosciences | 354235 | Usado en 16 Unidades: 30 min a RT |
| DNasa I | Sigma | DN25 | Usado a 0,5 mg / ml: 20-30 min a RT |
Enzimas Tabla 2. Utilizado para la digestión enzimática de la tráquea.
Referencias
- Bartlett, J. A., Fischer, A. J., McCray, P. B. Innate immune functions of the airway epithelium. Contrib. Microbiol. 15, 147-163 (2008).
- Finkbeiner, W. E. Physiology and pathology of tracheobronchial glands. Respir. Physiol. 118, 77-83 (1999).
- Hegab, A. E.
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Reimpresiones y permisos
