Summary

Генерация индуцированного регуляторных Т клеток из первичной человека наивного и Т-клеток памяти

Published: April 16, 2012
doi:

Summary

Мы опишем метод для создания нормативной, оперативной памяти и наивных Т-клеток из одной человеческой донорской крови. Поляризованный Tregs можно затем по сравнению с другими подмножества в различных генетических и функциональных приложений с генетической однородности, в том числе подавление анализ также подробно здесь.

Abstract

Разработка и сопровождение иммуносупрессивных CD4 + регуляторных Т-клеток (Tregs) способствуют периферической толерантности необходимо оставаться в иммунологический гомеостаз с огромным количеством себе и комменсальных антигенов и на организм человека. Возмущения в балансе между Tregs и воспалительных обычные Т-клеток может привести к иммунопатологии или рак. Хотя терапевтические инъекции Tregs было показано, что эффективность в мышиных моделях колита 1, тип диабета 2, ревматоидный артрит и трансплантат против хозяина, 4 несколько принципиальных отличий в сравнении с человеческой мыши Treg биологии 5, до сих пор препятствует клинического использования. Отсутствие достаточного количества, чистоты, стабильности и наведения специфику терапевтической Tregs необходимость динамическая платформа развития человека Treg, на котором для оптимизации условий для расширения своих бывших естественных 6.

Здесь уровня Дописывать круг метод дифференциации индуцированных Tregs (iTregs) из одной человеческой периферической крови доноров, которые могут быть разбиты на четыре этапа: изоляция мононуклеарных клеток периферической крови, магнитные выбор CD4 + Т-клетки, в пробирке культуру клеток и флуоресцентных активированный сортировки клеток (FACS) Т подмножеств клеток. С Treg подпись транскрипционный фактор forkhead окно P3 (FOXP3) является активация вызванных фактором транскрипции у людей 7 и никакой другой уникальный маркер существует, комбинаторной панели маркеров должны быть использованы для определения Т-лимфоцитов с супрессорной активности. После шести дней в культуре клетки в нашей системе может быть разграничены на наивных Т-клеток, Т-клетки памяти или iTregs на основе их относительной выражение CD25 и CD45RA. В ячейках памяти и наивных Т имеют различные сообщил поляризации требования и пластичности 8 предварительной сортировки исходной популяции Т-клеток в CD45RA + + и CD45RO подмножества может бE используется для изучения этих расхождений. В соответствии с другим, наши CD25 Привет CD45RA iTregs экспресс высокого уровня FOXP3 9 GITR и CTLA-4 11 и низкого уровня CD127 12. После FACS каждой популяции, полученные в результате клетки могут быть использованы в анализе супрессоров, которая оценивает относительную способность замедлить распространение карбоксифлуоресцеина сукцинимидил эфира (CFSE)-меченных аутологичных Т-клеток.

Protocol

1. Выделение человека мононуклеарных клеток периферической крови (МНПК) из шерсти Баффи Приобретает одну единицу слой кровяного сгустка из больницы или поблизости от расположения центра крови. Наш центр крови дает нам около 40-60 мл лейкомассы на единицу получил от нормальных доно?…

Discussion

Хотя Treg передачи держит огромный терапевтический обещание в борьбе с аутоиммунными отторжения трансплантата и других иммунных или воспалительных опосредованного нарушения, методы их эффективного формирования и стабильного обслуживания до сих пор не разработаны. Как только 1-5% цирку…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

<p class="jove_content"> Авторы выражают благодарность Дженнифер Странно и Грег Баумана за помощь в анализе потока цитометрии и сортировки. Эта работа была поддержана Количество NIH Грант 2P20 RR020171 от NCRR и Университета Кентукки средства для запуска FM; ГНС признает поддержку президентской стипендии Высшее и стипендий Кентукки возможностей.</p

Materials

Name of the reagent Company Catalogue Number Comments
Lymphoprep Axis-Shield 1114547 Keep at room temperature
Refrigerated Bench-Top Centrifuge Eppendorf 5810R  
Bright-Line Hemocytometer Hausser Scientific 3110  
EasySep Human CD4+ T Cell Enrichment Kit Stem Cell Technologies 19052  
EasySep Human Memory CD4+ T Cell Enrichment Kit Stem Cell Technologies 19157  
EasySep Human Naïve CD4+ T Cell Enrichment Kit Stem Cell Technologies 19155  
The Big Easy EasySep Magnet Stem Cell Technologies 18001 Silver
5 mL Round Bottom Polystyrene Tubes BD Falcon 352008  
15 mL Polypropylene Centrifuge Tubes VWR 89004-368  
14 mL Polypropylene Round-Bottom Tubes BD Falcon 352059  
50 mL Polypropylene Centrifuge Tubes VWR 89004-364  
Human anti-CD3 Antibody Bio X Cell BE0001-2 Clone: OKT3
24 Well Cell Polystyrene Culture Plate BD Falcon 353047  
96 Well Round Bottom Tissue Culture Plate Grenier Bio-One 650180  
RPMI 1640 with Glutamax-I and HEPES Buffer Gibco 72400  
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco 16000  
β-Mercaptoethanol Sigma M7522  
Recombinant Human TGF-β1 eBioscience 14-8348-62  
Recombinant Human IL-2 eBioscience 14-8029-63  
Bovine Serum Albumin (BSA) MP Biomedicals Inc. 810531  
0.5 M EDTA Amresco E177  
Mouse Anti-Human CD25-PE Miltenyi Biotec 130-091-024 Clone: 4E3
Mouse Anti-Human CD45RA-PE-Cy5 eBioscience 15-0458-42 Clone: HI100
Mouse Anti-Human CD127-APC Miltenyi Biotec 130-094-890 Clone: MB15-18C9
DNase II MP Biomedicals Inc. 190370  
MoFlo Flow Cytometer Beckman Coulter    
FlowJo Software Tree Star, Inc.    
Cell Quest Pro Software BD Biosciences    
Newborn Calf Serum Gibco 16010  
L-glutamine Gibco 25030  
AIM-V Gibco 0870112  
CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit Invitrogen C34554  
Treg Suppression Inspector Beads Miltenyi Biotec 130-092-909  
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140  
40 μM Nylon Cell Strainer BD Falcon 352340  

References

  1. Powrie, F., Correa-Oliveira, R., Mauze, S., Coffman, R. L. Regulatory interactions between CD45RBhigh and CD45RBlow CD4+ T cells are important for the balance between protective and pathogenic cell-mediated immunity. The Journal of Experimental Medicine. 179, 589-600 (1994).
  2. Tarbell, K. V. Dendritic cell-expanded, islet-specific CD4+ CD25+ CD62L+ regulatory T cells restore normoglycemia in diabetic NOD mice. The Journal of Experimental Medicine. 204, 191-201 (2007).
  3. Morgan, M. E. Effective treatment of collagen-induced arthritis by adoptive transfer of CD25+ regulatory T cells. Arthritis and Rheumatism. 52, 2212-2221 (2005).
  4. Taylor, P. A., Lees, C. J., Blazar, B. R. The infusion of ex vivo activated and expanded CD4(+)CD25(+) immune regulatory cells inhibits graft-versus-host disease lethality. Blood. 99, 3493-3493 (2002).
  5. Ziegler, S. F. FOXP3: of mice and men. Annual Review of Immunology. 24, 209-226 (2006).
  6. Riley, J. L., June, C. H., Blazar, B. R. Human T regulatory cell therapy: take a billion or so and call me in the morning. Immunity. 30, 656-6565 (2009).
  7. Morgan, M. E. Expression of FOXP3 mRNA is not confined to CD4+CD25+ T regulatory cells in humans. Human Immunology. 66, 13-20 (2005).
  8. Wang, J., Huizinga, T. W. J., Toew, R. E. M. De Novo Generation and Enhanced Suppression of Human CD4+CD25+ Regulatory T Cells by Retinoic Acid. Journal of Immunology. 183, 4119-4126 (2009).
  9. Hori, S., Nomura, T., Sakaguchi, S. Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3. Science (New York, N.Y.). 299, 1057-1061 (2003).
  10. McHugh, R. S. CD4(+)CD25(+) immunoregulatory T cells: gene expression analysis reveals a functional role for the glucocorticoid-induced TNF receptor. Immunity. 16, 311-323 (2002).
  11. Takahashi, T. Immunologic Self-Tolerance Maintained by Cd25+Cd4+Regulatory T Cells Constitutively Expressing Cytotoxic T Lymphocyte-Associated Antigen 4. The Journal of Experimental Medicine. 192, 303-310 (2000).
  12. Liu, W. CD127 expression inversely correlates with FoxP3 and suppressive function of human CD4+ T reg cells. The Journal of Experimental Medicine. 203, 1701-1711 (2006).
  13. Schraven, B., Kalinke, U. CD28 superagonists: what makes the difference in humans. Immunity. 28, 591-595 (2008).
  14. Reneer, M. C. Peripherally induced human Regulatory T cells uncouple Kv1.3 activation from TCR-associated signaling. European Journal of Immunology. , (2011).

Play Video

Cite This Article
Ellis, G. I., Reneer, M. C., Vélez-Ortega, A. C., McCool, A., Martí, F. Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Naïve and Memory T Cells. J. Vis. Exp. (62), e3738, doi:10.3791/3738 (2012).

View Video