Perfusion rétrograde et remplissage de la vascularisation coronaire souris comme préparation à l'imagerie par ordinateur Micro tomographie

Summary

Visualisation des vaisseaux coronaires est essentielle pour faire progresser notre compréhension des maladies cardio-vasculaires. Nous décrivons ici une méthode pour perfuser murin vasculaire coronaire avec un caoutchouc de silicone radio-opaque (Microfil), en préparation pour les micro-tomographie par ordinateur (μCT) d'imagerie.

Abstract

Visualisation de la vascularisation est de plus en plus important pour la compréhension de nombreux états pathologiques différentes. Bien que plusieurs techniques existent pour l'imagerie vasculaire, quelques-uns sont capables de visualiser le réseau vasculaire dans son ensemble tout en étendant à une résolution qui comprend le plus petit ^1,2 navires. En outre, de nombreuses techniques de moulage vasculaires détruire les tissus environnants, ce qui empêche une analyse plus approfondie de l'échantillon ^3-5. Une méthode qui contourne ces problèmes est la micro-tomographie par ordinateur (μCT). μCT imagerie permet de numériser à des résolutions de moins de 10 microns, est capable de produire des reconstitutions en 3D du réseau vasculaire, et laisse le tissu intact pour une analyse ultérieure (par exemple, l'histologie et la morphométrie) ^6-11. Toutefois, les navires d'imagerie par des méthodes in vivo ex μCT exige que les navires soient remplies avec un composé radio-opaque. En tant que tel, la représentation précise de la vascularisation produite par μCT imagerie est subordonnée àremplissage fiable et complète des vaisseaux. Dans ce protocole, nous décrivons une technique pour remplir des récipients de souris coronaires en préparation pour l'imagerie μCT.

Deux techniques existent prédominent pour le remplissage du système vasculaire coronaire: in vivo par perfusion canulation et rétrograde de l'aorte (ou une branche hors de l'arche aortique) ^12-14, ou ex vivo par l'intermédiaire d'un système de perfusion de Langendorff ^15-17. Nous décrivons ici une méthode in vivo canulation aortique qui a été spécifiquement conçu pour assurer le remplissage de tous les navires. On utiliser un composé radio-opaque appelé faible viscosité Microfil qui peut perfuser à travers les petits vaisseaux pour remplir tous les capillaires, ainsi que deux des côtés artériels et veineux du réseau vasculaire. Les navires sont perfusées avec le tampon en utilisant un système de perfusion sous pression, puis rempli de Microfil. Pour veiller à ce que Microfil remplit les petits vaisseaux de résistance plus élevés, nous ligaturer les grosses branches emanating à partir de l'aorte, qui dévie le Microfil dans les artères coronaires. Une fois le remplissage terminé, pour empêcher la nature élastique du tissu cardiaque de serrage Microfil sur des vaisseaux, on ligature accessibles principaux points de sortie vasculaires immédiatement après le remplissage. Par conséquent, notre technique est optimisé pour un remplissage complet et la rétention maximale de l'agent de remplissage, permettant la visualisation de l'ensemble du réseau vasculaire coronaire – artères, les capillaires et les veines ressemblent.

Protocol

1. Préparatifs avant de commencer Remplir chaque côté de l'appareil de perfusion sous pression avec un tampon vasodilatateur (4 mg / L de papavérine + 1 g / L adénosine dans du PBS) ou paraformaldéhyde 4% (PFA) dans du PBS, respectivement. Préparer une seringue à insuline 1/2cc (avec un 29G fixé en permanence ½ "aiguille) en le remplissant avec 0,1 ml de 1:100 héparine (stock 5000U/ml) et de tordre l'aiguille à l'angle ~ 120 degrés avec le biseau vers le haut. Faites le…

Discussion

Tissu cardiaque a une très forte demande métabolique, et nécessite donc un apport constant de nutriments et d'oxygène dans le sang fourni par le système vasculaire coronarien. Maladies des vaisseaux coronaires, qui diminuent la fonction coronarienne en raison de sténose du vaisseau et le blocage, peuvent conduire à une hypoxie tissulaire et de l'ischémie, et de mettre les patients affectés au risque d'infarctus du myocarde et des dommages irréparables au muscle cardiaque. Une meilleure compréhensi…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
1 ml syringes	Becton Dickinson	BD-309602
1/2cc insulin syringes with permanently attached 29G ½’ needles	Becton Dickinson	BD-309306
2″ x 2″ Gauze pads	Med101store.com	SKU 2208
24G ¾” Angiocath IV catheter	Becton Dickinson	BD-381112
26G ½”gauge needles	Becton Dickinson	BD-305111
Adenosine	Sigma	A9251	1g/L in PBS for Vasodilation Buffer (with Papaverine)
Angled Graefe Forceps	Fine Science Tools	11052-10
Cotton-tipped applicators: 6″ non-sterile	Cardinal Health	C15055-006
Curved Surgical Scissors	Fine Science Tools	14085-09
Dissecting stereoscope and light source	Nikon	NA	NA
Dissecting Tray, 11.5 x 7.5 inches	Cole-Parmer	YO-10915-12	Filled with tar for pinning down the mouse
Fine Curved Forceps	Aesculap	FD281R	Need two
Heparin, 5000 U/ml stock	APP Pharmaceuticals LLC	NDC 63323-047-10	1:100 dilution in water
KCl	Fisher	P217	Saturated solution in H2O
Ketamin  (Ketaset), 100 mg/ml stock	Fort Dodge, Overland Park, KS, USA	NDC 0856-2013-01	Mixed as 130 mg/kg body weight, with Xylazine in 0.9% saline
Microfil	Flow Tech	MV-122 (yellow). Other color options are also available.	Mix 1:1 by weight, with 10% by volume of curing agent. Prepare just before injection, and vortex to ensure it is well mixed
Non-sterile Suture: 6-0, braided silk	Harvard Apparatus	723287
Papaverine	American Regent Inc.	NDC 0517-4010-01	4mg/L in PBS for Vasodilation Buffer (with Adenosine)
Paraformaldehyde	Sigma	P6148	Prepared as 4% solution
Perfusion Apparatus			See figure 2
Spring Scissors	Fine Science Tools	15018-10
Xylazine (Anased), 20 mg/gl stock	Lloyd Labs	NADA #139-236	Mixed as 8.8 mg/kg body weight, with Ketamin in 0.9% saline