Kvantitativ afbildning af Lineage-specifikke Toll-lignende receptor-medieret signalering i monocytter og dendritiske celler fra små prøver af humant blod
Summary
Vi beskriver anvendelsen af ImageStream teknologi (<a href="http://www.amnis.com/" target="_blank"> Www.amnis.com</a>), Som kombinerer kvantitativ flowcytometri med samtidig høj opløsning digital billedbehandling, at kvantificere cellulære mekanismer primære immunceller fra veldefinerede patientgrupper. Vores undersøgelser giver et oplæg til translationelle undersøgelser for at kvantificere afstamning specifikke cellulære responser i små prøver fra underlagt årgange.
Abstract
Individuelle variationer i immunstatus bestemme svar på infektion og bidrage til sygdommens sværhedsgrad og resultat. Ældning er forbundet med en forøget modtagelighed for virale og bakterielle infektioner og faldt respons på vacciner med en veldokumenteret fald i humorale såvel som cellemedierede immunresponser 1,2. Vi har for nylig vurderet virkningerne af aldringen på Toll-lignende receptorer (TLRs) og de vigtigste komponenter i det medfødte immunsystem at opdage mikrobiel infektion og udløser antimikrobielle værtsforsvarsmekanismer svar 3. I en stor gruppe af sunde humane donorer viste vi, at perifere blodmonocytter fra ældre har reduceret ekspression og funktionen af visse TLRs 4 og lignende reducerede TLR niveauer og signalering responser i dendritiske celler (DC'er), antigen-præsenterende celler, som er drejelig i sammenhængen mellem medfødte og adaptive immunitet 5. Vi har vist dysregulering af TLR3 i makrofager end lavere produktion af IFN ved DC'er fra ældre donorer som reaktion på infektion med West Nile-virus 6,7.
Paramount til vores forståelse af immunosenescence og terapeutisk intervention er en detaljeret forståelse af bestemte celletyper reagerer og mekanisme (r) af signaltransduktion. Traditionelle undersøgelser af immunresponser ved billeddannelse af primære celler og opmåling cellemarkører ved FACS eller immunoblot har fremmet vores forståelse betydeligt, men disse forsøg generelt begrænset teknisk af lille prøvevolumen tilgængelig fra patienter og den manglende evne til at udføre komplekse laboratoriemetoder på flere humane prøver. ImageStream kombinerer kvantitativ flowcytometri med samtidig høj opløsning digital billedbehandling og dermed letter efterforskning i flere cellepopulationer samtidigt for en effektiv opsamling af patientens modtagelighed. Her har vi demonstrere brugen af ImageStream i udviklingslandene til at vurdere TLR7 / 8aktivering-medierede stigninger i phosphorylering og kernetranslokation af en nøgle transkriptionsfaktor NF-KB, som initierer transskription af mange gener, der er kritiske for immunresponser 8. Anvendelse af denne teknologi har også for nylig påvist en hidtil ukendt ændring af TLR5 signaleringen og NF-KB-vejen i monocytter fra ældre donorer, der kan bidrage til ændret immunforsvar hos aldrende 9.
Protocol
Discussion
De kritiske trin i brug af ImageStream for translationelle undersøgelser er udvælgelsen af relevante sammenligningsgrupper og optimering og validering af antistof specificitet. Forskelle mellem emnegrupper i det mærkede mål vil være indlysende ved histogrammer og celle billeder. I kombination med en grundig analyse af ændringer i de relevante receptorer og signalveje, vil disse data give værdifuld indsigt i mekanismer, der ligger til grund for forstyrrelse i immunsystemet i specialiserede grupper. Teknikken…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet delvist af NIH (N01 HHSN272201100019C, U19 AI 089992, og NCRR / GCRC Program M01-RR00125). Forfatterne erklærer ingen konkurrerende finansielle interesser og takke Dr. Mark Shlomchik, direktør for Yale Cell Sorter Core Facility.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-03 |
| R848 | Invivogen | tlrl-r848 |
| Paraformaldehyde (16%) | Electron Microscopy Sciences | 15710 |
| BD Perm/Wash | BD Biosciences | 554723 |
| CD14-PE | eBioscience | 12-0149-41 |
| CD4-PacBlue | BD Pharmingen | 68436 |
| Lineage cocktail 1 (lin 1)-FITC | BD Biosciences | 340546 |
| CD11c-PE | BD Biosciences | 347637 |
| CD123-PE | BD Biosciences | 340545 |
| rabbit anti-NF-κB (p65) | SantaCruz | SC-372 |
| Alexa647 F(ab’)2 goat anti-rabbit IgG | Invitrogen | A21246 |
| DAPI | Invitrogen | D21490 |
| ImageStream X | Amnis |
Table 1. Specific reagents and equipment.
| Cell type | FITC | PE | Alexa 647 | PacBlue |
| Monocyte | CD14 | NF-κB (p65) | ||
| mDC | Lin1 | CD11c | NF-κB (p65) | CD4 |
| pDC | Lin1 | CD123 | NF-κB (p65) | CD4 |
Table 2. Antibody panel for cell lineage staining of signaling pathways
Monocyte: CD14+
mDC: Lin1-, CD4dim, CD11c+
pDC: Lin1-, CD4dim, CD123+
Lin1 (lineage) marker includes CD3, CD14, CD19, CD20, CD56 markers for monocytes, NK cells, T & B cells.
References
- Linton, P. J., Dorshkind, K. Age-related changes in lymphocyte development and function. Nat. Immunol. 5, 133-139 (2004).
- Shaw, A. C. Dysregulation of Human Toll-like Receptor Function in Aging. Ageing Research Reviews. 10, 346-353 (2011).
- Medzhitov, R. Toll-like receptors and innate immunity. Nature Rev. Immunol. 1, 135-145 (2001).
- van Duin, D. Age-associated Defect in Human TLR1 Function and Expression. J. Immunol. 178, 970-975 (2007).
- Panda, A. Age-associated decrease in TLR function in primary human dendritic cells predicts influenza vaccine response. J. Immunol. 184, 2518-2527 (2010).
- Kong, K. -. F. Dysregulation of TLR3 impairs the innate immune response to West Nile virus in the elderly. J. Virol. 82, 7613-7623 (2008).
- Qian, F. Impaired interferon signaling in dendritic cells from older donors infected in vitro with West Nile virus. J. Infect. Dis. 203, 1415-1424 (2011).
- Hayden, M. S., Ghosh, S. NF-kappaB in immunobiology. Cell research. 21, 223-244 (2011).
- Qian, F. Age-associated elevation in TLR5 leads to increased inflammatory responses in the elderly. Aging Cell. 11, 104-110 (2011).
- George, T. C. Quantitative measurement of nuclear translocation events using similarity analysis of multispectral cellular images obtained in flow. Journal of immunological. 311, 117-129 (2006).
