Kvantitativ Imaging av Lineage-spesifikke Toll-like receptor-mediert signalering i monocytter og dendrittiske celler fra små prøver av Human Blood

Summary

Vi beskriver bruk av ImageStream teknologi (<a href="http://www.amnis.com/" target="_blank"> Www.amnis.com</a>), Kombinerer som kvantitativ flowcytometri med samtidig høy oppløsning digital bildebehandling, å kvantifisere cellulære mekanismene for primære immunceller fra veldefinerte pasientgrupper kohorter. Våre undersøkelser gir en blåkopi for translasjonsforskning undersøkelser for å kvantifisere avstamning spesifikke cellulære responser i små prøver fra fag kohorter.

Abstract

Individuelle variasjoner i immunstatus bestemme tiltak mot smitte og bidra til sykdommens alvorlighetsgrad og utfall. Aldring er assosiert med en økt mottakelighet for virus og bakterieinfeksjoner og redusert respons på vaksiner med en veldokumentert nedgang i humoral samt celle-mediert immunrespons ^1,2. Vi har nylig vurdert effekten av aldring på Toll-lignende reseptorer (TLRs), viktige komponenter i det medfødte immunsystemet som gjenkjenner mikrobiell infeksjon og trigger antimikrobielle vert forsvar svar ^3. I en stor kohort av friske mennesker givere, viste vi at perifere blod monocytter fra de eldre har redusert uttrykk og funksjon av visse TLRs ⁴ og lignende redusert TLR nivåer og signalering svar i dendrittiske celler (DCS), antigen-presentasjon celler som er sentrale i sammenhengen mellom medfødt og adaptiv immunitet ^5. Vi har vist feilregulering av TLR3 i makrofager end lavere produksjon av IFN av utviklingsland fra eldre donorer som respons på infeksjon med West Nile-viruset ^6,7.

Paramount til vår forståelse av immunosenescence og terapeutisk intervensjon er en detaljert forståelse av spesifikke celletyper svare og mekanismen (e) av signaltransduksjon. Tradisjonelle studier av immunreaksjoner gjennom avbildning av primære celler og oppmåling celle markører ved FACS eller immunoblot har utvidet vår forståelse betydelig, men disse studiene er generelt begrenset teknisk av den lille prøvevolum tilgjengelig fra pasienter og manglende evne til å gjennomføre komplekse laboratorieteknikker på flere humane prøver. ImageStream kombinerer kvantitativ flowcytometri med samtidig høy oppløsning digital bildebehandling og dermed forenkler etterforskning i flere celle populasjoner møtereferat for en effektiv fangst av pasientens følsomhet. Her kan vi demonstrere bruk av ImageStream i utviklingsland for å vurdere TLR7 / 8aktivering-mediert økning i fosforylering og kjernefysisk translokasjon av en nøkkel transkripsjonsfaktor, NF-κB, som initierer transkripsjon av mange gener som er kritiske for immunreaksjoner ^8. Ved hjelp av denne teknologien, har vi også nylig demonstrert en tidligere ikke endring av TLR5 signalering og NF-κB spredningsveier i monocytter fra eldre givere som kan bidra til endret immunrespons i aldring ^9.

Protocol

1. Isolering og stimulering av immunceller Skaff 10-50 ml heparinisert blod fra friske frivillige etter skriftlig informert samtykke i henhold til retningslinjene i den lokale Institutional Review Board. For studier av aldring eller sykdom patogenese, utestenging og inklusjonskriteriene for hver frivillig eller pasient må eksplisitt bestemt. Isoler humane perifere mononukleære blodceller (PBMCs) med CPT-rør eller Ficoll-Paque Plus i henhold til produsentens instruksjoner (GE Healthcare, NJ) og ut…

Discussion

De kritiske trinn i bruk av ImageStream for translasjonsforskning studier er utvalget av aktuelle sammenligningsgruppene og optimalisering og validering av antistoffspesifisitet. Forskjeller mellom faggruppene i merket målet vil være lett synlig gjennom histogrammer og celle bilder. I kombinasjon med en grundig analyse av endringer i relevante reseptorer og signalveier, vil disse dataene gi verdifull innsikt i mekanismer som ligger til grunn immun feilregulering i spesialiserte kohorter. Teknikken vil være begrenset …

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare	17-1440-03
R848	Invivogen	tlrl-r848
Paraformaldehyde (16%)	Electron Microscopy Sciences	15710
BD Perm/Wash	BD Biosciences	554723
CD14-PE	eBioscience	12-0149-41
CD4-PacBlue	BD Pharmingen	68436
Lineage cocktail 1 (lin 1)-FITC	BD Biosciences	340546
CD11c-PE	BD Biosciences	347637
CD123-PE	BD Biosciences	340545
rabbit anti-NF-κB (p65)	SantaCruz	SC-372
Alexa647 F(ab’)2 goat anti-rabbit IgG	Invitrogen	A21246
DAPI	Invitrogen	D21490
ImageStream X	Amnis

Table 1. Specific reagents and equipment.

Cell type	FITC	PE	Alexa 647	PacBlue
Monocyte		CD14	NF-κB (p65)
mDC	Lin1	CD11c	NF-κB (p65)	CD4
pDC	Lin1	CD123	NF-κB (p65)	CD4

Table 2. Antibody panel for cell lineage staining of signaling pathways

Monocyte: CD14+
mDC: Lin1-, CD4dim, CD11c+
pDC: Lin1-, CD4dim, CD123+
Lin1 (lineage) marker includes CD3, CD14, CD19, CD20, CD56 markers for monocytes, NK cells, T & B cells.