Kvantitativ avbildning av Lineage-specifika Toll-like receptor-medierad signalering i monocyter och dendritiska celler från små Prover av blod
Summary
Vi beskriver användningen av ImageStream teknik (<a href="http://www.amnis.com/" target="_blank"> Www.amnis.com</a>), Kombinerar vilka kvantitativa flödescytometri med samtidig hög upplösning digital bildbehandling, att kvantifiera cellulära mekanismer för primära immunceller från väldefinierade patientgrupper. Våra studier ger en modell för translationella undersökningar för att kvantifiera härstamning specifika cellulära reaktioner i små prover från föremål kohorter.
Abstract
Individuella variationer i immunstatus avgör svar på infektion och bidra till sjukdomens svårighetsgrad och utfall. Åldrande är förknippat med en ökad mottaglighet för virus-och bakterieinfektioner och minskade känslighet för vacciner med en väldokumenterad minskning humorala såväl som cellförmedlade immunsvar 1,2. Vi har nyligen utvärderat effekterna av åldrande på Toll-liknande receptorer (TLRs), viktiga komponenter i det medfödda immunförsvaret som detekterar mikrobiell infektion och utlösa antimikrobiella värdens svar Defense 3. I en stor grupp av friska humana donatorer, visade vi att perifera blodmonocyter från äldre har minskat uttryck och funktion hos vissa TLRs 4 och liknande reducerade nivåer TLR och signalering svar i dendritiska celler (DC), antigen-presenterande celler som är svängbar i kopplingen mellan medfödda och adaptiva immuniteten 5. Vi har visat dysreglering av TLR3 i makrofager end lägre produktion av IFN av DCS från äldre donatorer som svar på infektion med West Nile virus 6,7.
Största vikt för vår förståelse av immunosenescence och terapeutisk intervention är en detaljerad förståelse av specifika celltyper svara och mekanismen (er) signaltransduktion. Traditionella studier av immunsvar genom avbildning av primära celler och mätningsteknik markörer cell genom FACS eller immunoblot har avancerat vår förståelse avsevärt, men dessa studier begränsas i allmänhet tekniskt av den lilla provvolymen tillgängliga från patienter och oförmåga att genomföra komplexa laboratoriemetoder på flera humana prover. ImageStream kombinerar kvantitativa flödescytometri med samtidig hög upplösning digital bildbehandling och därmed underlättar utredningar i flera cellpopulationer samtidigt för en effektiv infångning av patientens känslighet. Här visar vi att använda ImageStream i utvecklingsländerna att bedöma TLR7 / 8aktivering-medierade ökningar i fosforylering och nukleär translokation av en nyckel transkriptionsfaktor NF-kB, som initierar transkription av många gener som är kritiska för immunsvar 8. Med denna teknik har vi också nyligen visat en tidigare okänd förändring av TLR5 signalering och NF-kB vägen i monocyter från äldre donatorer som kan bidra till förändrade immunförsvar i åldrande 9.
Protocol
Discussion
De kritiska steg i användningen av ImageStream för translationella studier är valet av relevanta jämförelsegrupper och optimering och validering av antikropp specificitet. Skillnaderna mellan ämnet grupper i det märkta målet kommer att vara uppenbara genom histogram och bilder cell. I kombination med en noggrann analys av förändringar i relevanta receptorer och signalvägar, kommer dessa data ger värdefull insikt i mekanismerna som ligger bakom immun dysreglering i specialiserade kohorter. Tekniken kommer att…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes delvis av NIH (N01 HHSN272201100019C, U19 AI 089.992 och NCRR / GCRC Program M01-RR00125). Författarna förklarar några konkurrerande ekonomiska intressen och tacka Dr Mark Shlomchik, chef för Yale Cell Sorter Core Facility.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-03 |
| R848 | Invivogen | tlrl-r848 |
| Paraformaldehyde (16%) | Electron Microscopy Sciences | 15710 |
| BD Perm/Wash | BD Biosciences | 554723 |
| CD14-PE | eBioscience | 12-0149-41 |
| CD4-PacBlue | BD Pharmingen | 68436 |
| Lineage cocktail 1 (lin 1)-FITC | BD Biosciences | 340546 |
| CD11c-PE | BD Biosciences | 347637 |
| CD123-PE | BD Biosciences | 340545 |
| rabbit anti-NF-κB (p65) | SantaCruz | SC-372 |
| Alexa647 F(ab’)2 goat anti-rabbit IgG | Invitrogen | A21246 |
| DAPI | Invitrogen | D21490 |
| ImageStream X | Amnis |
Table 1. Specific reagents and equipment.
| Cell type | FITC | PE | Alexa 647 | PacBlue |
| Monocyte | CD14 | NF-κB (p65) | ||
| mDC | Lin1 | CD11c | NF-κB (p65) | CD4 |
| pDC | Lin1 | CD123 | NF-κB (p65) | CD4 |
Table 2. Antibody panel for cell lineage staining of signaling pathways
Monocyte: CD14+
mDC: Lin1-, CD4dim, CD11c+
pDC: Lin1-, CD4dim, CD123+
Lin1 (lineage) marker includes CD3, CD14, CD19, CD20, CD56 markers for monocytes, NK cells, T & B cells.
References
- Linton, P. J., Dorshkind, K. Age-related changes in lymphocyte development and function. Nat. Immunol. 5, 133-139 (2004).
- Shaw, A. C. Dysregulation of Human Toll-like Receptor Function in Aging. Ageing Research Reviews. 10, 346-353 (2011).
- Medzhitov, R. Toll-like receptors and innate immunity. Nature Rev. Immunol. 1, 135-145 (2001).
- van Duin, D. Age-associated Defect in Human TLR1 Function and Expression. J. Immunol. 178, 970-975 (2007).
- Panda, A. Age-associated decrease in TLR function in primary human dendritic cells predicts influenza vaccine response. J. Immunol. 184, 2518-2527 (2010).
- Kong, K. -. F. Dysregulation of TLR3 impairs the innate immune response to West Nile virus in the elderly. J. Virol. 82, 7613-7623 (2008).
- Qian, F. Impaired interferon signaling in dendritic cells from older donors infected in vitro with West Nile virus. J. Infect. Dis. 203, 1415-1424 (2011).
- Hayden, M. S., Ghosh, S. NF-kappaB in immunobiology. Cell research. 21, 223-244 (2011).
- Qian, F. Age-associated elevation in TLR5 leads to increased inflammatory responses in the elderly. Aging Cell. 11, 104-110 (2011).
- George, T. C. Quantitative measurement of nuclear translocation events using similarity analysis of multispectral cellular images obtained in flow. Journal of immunological. 311, 117-129 (2006).
