Presentiamo un metodo per formare una finestra di imaging nel cranio topo che si estende millimetri ed è stabile per mesi senza infiammazione cerebrale. Questo metodo è adatto per studi longitudinali di flusso sanguigno, dinamica cellulare, e cellule / struttura vascolare con microscopia a due fotoni.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Un lucido e rinforzato Assottigliato cranio-Window a lungo termine Imaging del cervello di topo
In questo articolo
Sommario
Abstract
In vivo imaging della funzione corticale richiede l'accesso ottico al cervello senza interruzioni dell'ambiente intracranica. Vi presentiamo un metodo per formare un cranio lucido e rinforzato diluito (porte) finestra nel cranio del mouse che si estende su parecchi millimetri di diametro ed è stabile per mesi. Il cranio è diluito a 10 a 15 pm di spessore con una mano trapano per ottenere chiarezza ottica, e viene poi ricoperto con colla di cianoacrilato e un vetro di copertura a: 1) fornire rigidità, 2) inibiscono la ricrescita ossea e 3) ridurre la dispersione della luce da irregolarità sulla superficie dell'osso. Dal momento che il cranio non è violato, qualsiasi infiammazione che potrebbe influenzare il processo in fase di studio è notevolmente ridotto. Imaging profondità fino a 250 um sotto la superficie corticale può essere realizzato utilizzando due fotoni microscopia a scansione laser. Questa finestra è particolarmente adatta a studiare il flusso ematico cerebrale e la funzione cellulare in preparazioni sia anestetizzati e sveglio. Offre inoltre l'opportunità di manipolare l'attività delle cellule utilizzando optogenetics o per interrompere il flusso di sangue nei vasi destinatari irradiazione di circolazione fotosensibilizzanti.
Protocollo
1. Preparazione per la chirurgia i
- Pulire gli strumenti chirurgici dalla sonicazione in una miscela di latte Maxizyme e chirurgica in un pulitore ad ultrasuoni. Sterilizzare gli strumenti chirurgici prima di ogni esperimento.
- Assicurarsi che tutti i reagenti necessari e monouso sono disponibili. Un elenco di reagenti e prodotti monouso è fornita in Tabella 2. Reagenti e monouso che vengono in contatto con il tessuto esposto deve essere sterile, quando possibile.
- Indurre l'anestesia. Anestetici tipici adatti per studi di sopravvivenza sono descritti nella Tabella 1. Garantire piano di anestesia chirurgica controllando per ....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Two-photon immagini attraverso una finestra Porte richiede la trasmissione attraverso l'osso assottigliata e la dura madre, che attenua la luce laser e aggiunge aberrazioni ottiche a maggiori profondità 8. Tuttavia, nonostante questo inconveniente, profondità di imaging fino a 250 um sotto la superficie piale può essere ottenuto con eccitazione 900 nm. Profondità maggiori di imaging possono in linea di principio essere possibile con lunghezze d'onda di eccitazione più 13. Un importante vant.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Niente da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dalla American Heart Association (Post-doctoral fellowship a AYS) e il National Institutes of Health (MH085499, EB003832 e OD006831 a DK). Ringraziamo Beth Friedman e Pablo Blinder per i commenti sul manoscritto.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti | |||
|---|---|---|---|---|---|---|
| Agente | Via di consegna | Dose per il mouse | Durata | Note | Fonte | Rif. Rif. |
| Pentobarbital (Nembutal) | IP | 90 ug / g | 15-60 min | Margine di sicurezza stretta. Lavorare fino a giusta dose di anestesia lentamente. Supplemento 10% della dose di induzione come richiesto. | 036093; Butler Schein | 7 |
| Ketamina (Ketaset) miscelato con Xylazina (Anased) | IP | 60 mcg / g (K) 10 pg / g (X) (in miscela stessa siringa) | 20-30 min | Xilazina è co-iniettata come un rilassante muscolare e analgesico. Supplemento solo ketamina al 50% della dose di induzione come richiesto. | (K) 010.177, (X) 033.198; Butler Schein | 7 |
| Isoflurano (Isothesia) | Inalazione | 4% concentrazione media alveolare (MAC) per l'induzione; 1-2% MAC per la manutenzione | 4-6 h. | Purché in miscela di 70% di ossigeno e il 30% di ossido di azoto. L'anestesia prolungata porta a rallentare il recupero. | 029403; Butler Schein | 26 |
Tabella 1. Consigliato agenti anestetici per gli studi di sopravvivenza.
| VOCE | AZIENDA | CATALOGO # / MODEL |
|---|---|---|
| Betadine | Butler Schein | 6906950 |
| Buprenorfina (Buprenex) | Butler Schein | 031919 |
| Isotiocianato di fluorescina destrano, 2 MDa peso molecolare | Sigma | FD2000S |
| Alcol isopropilico | Pescatore | AC42383-0010 |
| Soluzione di Ringer lattato | Butler Schein | 009846; |
| Lidocaina soluzione, 2% (v / v) | Butler Schein | 002468 |
| Salino | Butler Schein | 009861 |
| Milk chirurgico | Butler Schein | 014.325 |
| Texas Red destrano, 70 kDa peso molecolare | Invitrogen | D1864 |
| Maxizyme | Butler Schein | 035646 |
| MONOUSO | ||
| Carbide sbavature, ugello di dimensioni 1/2 mm | Strumenti di Scienze Belle | 19007-05 |
| Applicatori punta la foglia | Fisher Scientific | 23-400-100 |
| Vetro di copertura, no. 0 spessore | Thomas Scientific | 6661B40 |
| Colla di cianoacrilato | ND Industries | H04308 31428 |
| Gas duster | Newegg | N82E16848043429 |
| Grip di cemento in polvere | Dentsply | 675571 |
| Grip cemento solvente | Dentsply | 675572 |
| Insulina siringa, 0,3 mL di volume con il 29,5 gauge | Butler Schein | 018384 |
| Dado e bullone per fissare la testa | Digikey | Dado, H723-ND, bullone, R2-56X1/4-ND |
| Unguento oftalmico | Butler Schein | 039886 |
| Lame di bisturi | Fisher Scientific | 12-460-448 |
| Viti, autofilettante # 000 | JI Morris Azienda | FF000CE125 |
| Silicone sigillante acquario | Perfecto Manufacturing | 31001 |
| Tin polvere di ossido di | Mama Minerals | EQT-TINOX |
| ATTREZZATURE | ||
| Glass scriba | Fisher Scientific | 08-675 |
| Dissezione microscopio | Carl Zeiss | OPMI FC-1 |
| Trapano elettrico alimentato | Foredom o Osada | K.1020 (Foredom) o EXL-M40 (Osada) |
| Rasoio elettrico | Wahl | Serie 8900 |
| Pinza, Dumont no. 55 | Strumenti di Scienze Belle | 11255-20 |
| Commenti pad termico regolamentato | FHC | 40-90-8 (termistore rettale, 40-90-5D-02; hmangiare pad, 40-90-2-07) |
| Vaporizzatore isoflurano | Ohmeda | IsoTec4 |
| Pulsossimetro | Starr Life Sciences | MouseOx |
| Cacciavite miniatura | Garret Wade | 26B09.01 |
| Telaio stereotassico | Kopf Instruments | Modello 900 (con maschera del mouse l'anestesia e non rottura barre di auricolari) |
| Forbici chirurgiche, fine blunt | Strumenti di Scienze Belle | 14078-10 |
| Pulitore ad ultrasuoni | Fisher Scientific | 15-335-30 |
Tabella 2. Elenco dei reagenti specifici e le attrezzature, i materiali monouso.
Riferimenti
- Cetin, A. Stereotaxic gene delivery in the rodent brain. Nature Protocols. 1, 3166-3173 (2006).
- Kleinfeld, D., Delaney, K. R. Distributed representation of vibrissa movement in the upper layers of somatosensory cortex re....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
