के लेटरल और सभ्य न्यूरॉन्स में झिल्ली प्रोटीन का प्रसार exocytosis प्रतिदीप्ति रिकवरी और प्रतिदीप्ति नुकसान Photobleaching का उपयोग मूल्यांकन

Summary

इस रिपोर्ट को जीवित कोशिका इमेजिंग और photobleach तकनीक का उपयोग करने के लिए सतह अभिव्यक्ति, परिवहन रास्ते और exogenously व्यक्त, पीएच के प्रति संवेदनशील GFP टैग न्यूरॉन्स के प्लाज्मा झिल्ली में प्रोटीन की तस्करी कैनेटीक्स निर्धारित करने का वर्णन करता है.

Abstract

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This directed trafficking is of fundamental importance to deliver, maintain or remove synaptic proteins.

Super-ecliptic pHluorin (SEP) is a pH-sensitive derivative of eGFP that has been extensively used for live cell imaging of plasma membrane proteins^1-2. At low pH, protonation of SEP decreases photon absorption and eliminates fluorescence emission. As most intracellular trafficking events occur in compartments with low pH, where SEP fluorescence is eclipsed, the fluorescence signal from SEP-tagged proteins is predominantly from the plasma membrane where the SEP is exposed to a neutral pH extracellular environment. When illuminated at high intensity SEP, like every fluorescent dye, is irreversibly photodamaged (photobleached)^3-5. Importantly, because low pH quenches photon absorption, only surface expressed SEP can be photobleached whereas intracellular SEP is unaffected by the high intensity illumination^6-10.

FRAP (fluorescence recovery after photobleaching) of SEP-tagged proteins is a convenient and powerful technique for assessing protein dynamics at the plasma membrane. When fluorescently tagged proteins are photobleached in a region of interest (ROI) the recovery in fluorescence occurs due to the movement of unbleached SEP-tagged proteins into the bleached region. This can occur via lateral diffusion and/or from exocytosis of non-photobleached receptors supplied either by de novo synthesis or recycling (see Fig. 1). The fraction of immobile and mobile protein can be determined and the mobility and kinetics of the diffusible fraction can be interrogated under basal and stimulated conditions such as agonist application or neuronal activation stimuli such as NMDA or KCl application^8,10.

We describe photobleaching techniques designed to selectively visualize the recovery of fluorescence attributable to exocytosis. Briefly, an ROI is photobleached once as with standard FRAP protocols, followed, after a brief recovery, by repetitive bleaching of the flanking regions. This ‘FRAP-FLIP’ protocol, developed in our lab, has been used to characterize AMPA receptor trafficking at dendritic spines¹⁰, and is applicable to a wide range of trafficking studies to evaluate the intracellular trafficking and exocytosis.

Protocol

1. सेल संस्कृति, वायरल ट्रांसडकशन, और प्रोटीन अभिव्यक्ति संस्कृति इन विट्रो (div) में 14-25 दिनों के लिए पाली एल Lysine लेपित गिलास coverslips पर भ्रूण 18 दिन (E18) चूहा पिल्ले से उच्च घनत्व hippocampal न्यूरॉन्स. 6 24hrs से पहले जीना प्रयोगों के लिए, साथ तनु Sindbis वायरस transduce कोशिकाओं ब्याज की झिल्ली प्रोटीन, सुपर के क्रांतिवृत्त pHluorin (सितम्बर) के साथ टैग युक्त. मध्यम pseudovirion युक्त सीधे वातानुकूलित मीडिया के 1mL युक्त coverslip जोड़ें और संस्कृति इनक्यूबेटर लौटे. अनुमापांक और समय प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए वायरल पारगमन के बाद वायरस बैच के आधार पर अलग – अलग रहते सेल प्रयोगों के शुरू करने से पहले प्रत्येक बैच के लिए निर्धारित किया जाना चाहिए. 2. FRAP फ्लिप लाइव सेल इमेजिंग उपकरण सेट अप Zeiss Axiovert एल एस एम 510 मेटा confocal सूक्ष्मदर्शी की इमेजिंग कक्ष coverslip स्थानांतरण.इमेजिंग के दौरान बिजली उतार चढ़ाव कम से कम सुनिश्चित करने के लिए, खुर्दबीन से पर बंद किया गया है, 100% लेजर उत्पादन के साथ, कम से कम 20 मिनट के लिए इमेजिंग के लिए पहले. तुरंत, पूर्व गर्म के साथ संस्कृति के माध्यम की जगह (37 डिग्री सेल्सियस) बाह्य रिकॉर्डिंग 140 मिमी NaCl, 5 मिमी, KCl, 15 मिमी ग्लूकोज, 1.5 मिमी 2 CaCl, 1.5 मिमी 2 MgCl, 20-25 मिमी HEPES (पीएच को समायोजित युक्त समाधान NaOH के साथ) 7.4 और Zeiss Axiovert मंच पूर्व गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) पर कक्ष जगह है. सुनिश्चित करें कोशिकी रिकॉर्डिंग समाधान की osmolarity को अपनी संस्कृति के माध्यम के 10 mOsM के भीतर समायोजित किया जाता है. कोई महत्वपूर्ण वाष्पीकरण प्रयोग की timecourse के के दौरान होता है प्रोवाइडेड में, इस सीओ 2 स्वतंत्र समाधान कम (<10 बजे) प्रयोगों के लिए उपयुक्त है. 1-2 मिमी सोडियम बिकारबोनिट के साथ सप्लीमेंट की सिफारिश की है. इमेजिंग कब्जा मापदंडों परिभाषित सबसे पहले, एक रीकॉम्बीनैंट समर्थक व्यक्त न्यूरॉन पहचानब्याज की TEIN और यह ध्यान में लाना है. साथ एक 63X तेल आपत्ति है, कम लेजर सत्ता में पूरे 488nm लेजर प्रकाश उत्तेजना का उपयोग करते हुए सेल की एक छवि प्राप्त. कम से कम photobleaching, (7-9) एक तेजी से नाममात्र की गति और कम पिक्सेल संकल्प (512-512) <1 सेकंड कुल स्कैन गति रखने का उपयोग करें. आरओआई (~ 1.5-2.5 एक्स ऑप्टिकल जूम) युक्त फ्रेम पर कब्जा dendrite की छवि और ज़ूम करने के लिए भाग का चयन करें. जहां संभव हो, सुनिश्चित करने के लिए, देखने के क्षेत्र में कई प्रक्रियाओं इतना है कि संदर्भ dendrites से माप प्राप्त किया जा सकता है, यदि गैर – विशिष्ट कारण अधिग्रहण होने वाली है photobleaching निर्धारित करने के लिए. फिल्टर, pinhole, स्कैन गति और डिटेक्तार के लिए कम से कम लेजर उत्तेजना से लेकिन सीमित संतृप्ति के साथ अधिक से अधिक प्रतिदीप्ति सक्षम लाभ को समायोजित करें. एक बड़ी pinhole व्यास की सिफारिश की है, फोटोन संग्रह को अधिकतम (2μm कांटा और त्रिगुट dendrites के लिए उपयुक्त है). डिटेक्टर काफी मजबूत है छोटे प्रतिदीप्ति वेतन वृद्धि का पता लगाने के लाभ होना चाहिए,ऐसी है कि बहुत पहले छवियों, photobleaching पहले संतृप्त पिक्सल के 10% को दूर नहीं है. इस पूर्व / पोस्ट – ब्लीच और प्रयोग की वसूली चरणों के लिए इस्तेमाल किया जा विन्यास सहेजें. अगले photobleach क्षेत्रों को परिभाषित है, और बाद दोहराव photobleaching चरण के लिए प्रारंभिक photobleach flanking क्षेत्रों के लिए एक रॉय का चयन. Flanking क्षेत्रों पर्याप्त चौड़ा करने के लिए स्कैन (5 आम तौर पर माइक्रोन, छवि देखते हैं 2.) के बीच प्रसार द्वारा वसूली को रोकने के हैं सुनिश्चित करें. लिए दोनों photobleach ROIs bleach पैरामीटर समायोजित करें. प्रारंभिक photobleach तेजी (.1-0.5 सेकंड) 1-5 पुनरावृत्तियों के बीच की आवश्यकता होती है, ऑप्टिकल ज़ूम और लागत पर लाभ की मात्रा पर निर्भर करता है होना चाहिए. Flanking क्षेत्रों के लिए, लेजर उत्तेजना flanking क्षेत्रों के निरंतर photobleaching सुनिश्चित करने के लिए समायोजित किया जाना चाहिए, लेकिन बिना phototoxic नुकसान के. एक दिशानिर्देश के रूप में, हम दोहराव photobleaching पीएच के लिए 100% प्रारंभिक photobleach के लिए लेजर उत्तेजना, और 10% का उपयोगase. छवि अधिग्रहण एक बार सभी मापदंडों सेट किया गया है, एक चर समय चूक छवि अनुक्रम के रूप में प्रयोग FRAP फ्लिप, 4 ब्लॉक में नीचे उल्लिखित प्रदर्शन: ब्लॉक 1: 3-10 पूर्व ब्लीच आधारभूत छवियों कम लेजर शक्ति पर कोई समय में देरी 2 ब्लॉक: Photobleach का पूर्ण लेजर शक्ति पर केंद्रीय लागत पर लाभ, 1-5 पुनरावृत्तियों 3 ब्लॉक: 3-10 के बाद ब्लीच वसूली छवियों 4 ब्लॉक: मध्यम लेजर शक्ति पर flanking क्षेत्रों की छवि पर कब्जा करने के साथ 1 के एक विशिष्ट समय अंतराल पर दोहरावदार photobleach – 5 सेकंड, जांच के तहत प्रोटीन की वसूली दर पर निर्भर करता है. अंत में, रिकॉर्डिंग pH6 140 मिमी NaCl, 5 मिमी KCl, 15mm ग्लूकोज, 1.5 मिमी 2 CaCl, 1.5 मिमी 2 MgCl, 20-25 मिमी एमईएस (प्रतिदीप्ति बुझाना) या 50 मिमी के साथ पूरित युक्त बफर समाधान के साथ बाह्य रिकॉर्डिंग समाधान की जगह NH4Cl 90 मिमी, NaCl 5 मिमी KCl, 15 मिमी ग्लूकोज, 1.8 मिमी 2 CaCl, 0.8 मिमी से युक्त2 MgCl, 20-25 मिमी HEPES, pH7.4 (कम पीएच intracellular दुकानों में प्रोटीन प्रकट), (छवि देखते हैं 2.). प्रत्येक पुनः संयोजक प्रोटीन के लिए कम से कम 10 से 20 डेटा के सेट ले लीजिए, सांख्यिकीय विश्लेषण को सक्षम करने के लिए. पूर्वाग्रह परिणाम से बचने के लिए सुनिश्चित करने के लिए, इमेजिंग शर्तों प्रतिकृति भर अनुरूप रखा जाता है. त्यागें किसी भी डेटा सेट जहां अधूरा विरंजन, महत्वपूर्ण फोकल हवाई जहाज़ बहाव या phototoxic कोशिका क्षति मनाया जाता है. 3. डेटा विश्लेषण ImageJ सॉफ्टवेयर के साथ छवियों को खोलें. कठोर शरीर → ढेर xy विमान में छोटे उतार चढ़ाव है कि समय Stackreg प्लगइन (plugins के stackreg → → परिवर्तन का उपयोग कर श्रृंखला के दौरान हुई हो सकती है के लिए खाते में संरेखित करें ). Zeiss confocal पर लिया छवियों के लिए, एल एस एम उपकरण बॉक्स प्लगइन का उपयोग करने के लिए एक पाठ फ़ाइल के रूप में समय मान (plugins के में → LSM साधन → नक्शा एल एस एम साधन की रिपोर्ट → → ),और एक विश्लेषण स्प्रेडशीट में इन मूल्यों का आयात. फ्लिप प्रयोग FRAP दौरान प्रतिदीप्ति उतार चढ़ाव को मापने के लिए, व्यक्ति पिक्सेल क्षेत्रों (~~ 20pixels में) में photobleached खंड विभाजित है और हर समय बिंदु (एफ) पर इन ROIs का मतलब प्रतिदीप्ति उपाय. को जल्दी से इन मूल्यों को प्राप्त करने के लिए, कई ImageJ आरओआई प्रबंधक 'विश्लेषण उपकरण (→ → उपकरण आरओआई प्रबंधक विश्लेषण) का उपयोग ROIs चयन और पिक्सेल प्रति मतलब प्रतिदीप्ति प्लॉट' z-अक्ष प्रोफ़ाइल '(कमांड का उपयोग रिपोर्ट छवि → ढेर → प्लॉट Z अक्ष) प्रोफ़ाइल. के लिए एक पृष्ठभूमि, गैर फ्लोरोसेंट क्षेत्र के प्रतिदीप्ति तीव्रता को मापने के लिए इस चरण को दोहराएँ. हर समय बिंदु पर पृष्ठभूमि मूल्यों घटाकर के प्रयोगात्मक शोर को दूर करने के लिए, और मतलब आधारभूत पूर्व प्रक्षालित उपाय द्वारा सभी मानों को विभाजित द्वारा प्रतिदीप्ति तीव्रता के अनुसार. आसन्न गैर photobleached dendrites के प्रतिदीप्ति तीव्रता को मापने के लिए गैर विशिष्ट स्तर का आकलनअधिग्रहण के दौरान photobleaching. गैर विशिष्ट photobleaching के लिए सुधार 'FRAP फ्लिप' डेटा की व्याख्या के लिए हतोत्साहित किया जाता है और जब भी संभव से बचा जाना चाहिए. गणना अगर महत्वपूर्ण वसूली लागत पर लाभ में जगह ले ली है, अनुक्रम के अंतिम 5-10 उपायों के पहले 5-10 उपायों के (ΔF) के माध्य से मतलब घटाना और सांख्यिकीय महत्व को निर्धारित है. ठीक और गैर – ठीक ROIs श्रेणीबद्ध exocytosis के पैटर्न (यानी exocytosis के आकर्षण के केंद्र या रीढ़ बनाम शाफ्ट वसूली) का आकलन है. 4. प्रतिनिधि परिणाम ठेठ FRAP – फ्लिप प्रयोग के परिणाम में छवि में दिखाया गया है. 2. यहाँ, एक AMPA प्रकार ग्लूटामेट रिसेप्टर, सितम्बर के साथ टैग की GluA2 सबयूनिट व्यक्त न्यूरॉन चुनिंदा किया गया है dendrite के एक क्षेत्र के साथ photobleached. अंजीर 2.A dendrite का क्षेत्र है जो imaged किया गया है और ROIs कि photobleaching (सफेद बॉक्स क्षेत्रों) के लिए चुना गया है इंगित करता है दिखाता है. गुई बड़े सफेद बॉक्स्ड क्षेत्र एक बार प्रक्षालित किया गया था flanking बॉक्सिंग क्षेत्रों, डबल अध्यक्षता में नीले तीर के साथ प्रकाश डाला विरंजन दोहराव के बाद. लाल तीर मापा लागत पर लाभ, कम पैनल में उच्च वृद्धि में दिखाया इंगित करता है. अंजीर 2.B प्रयोग के समय के पाठ्यक्रम पर मापा लागत पर लाभ में प्रतिदीप्ति तीव्रता से पता चलता है. इस उदाहरण में, एक मिनट की वसूली अवधि प्रारंभिक photobleach के बाद दर्ज किया गया था करने के लिए कड़ा रिसेप्टर्स पार्श्व प्रसार द्वारा रॉय प्रवेश करने की अनुमति है. Flanking क्षेत्रों photobleached कर रहे हैं, रिसेप्टर्स की यह अत्यधिक गतिशील अंश से प्रतिदीप्ति संकेत केंद्रीय क्षेत्र से occluded है, और इस क्षेत्र के भीतर उन पतला कर रहे हैं. 'फ्लिप' अनुक्रम पर मनाया प्रतिदीप्ति (ΔF) में वृद्धि इसलिए Sep-GluA2 के वृक्ष के समान शाफ्ट में प्रविष्टि के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है. कम पीएच धोने और 7.4 पीएच NH4Cl अलावा क्रमशः पुष्टि करते हैं कि मापा प्रतिदीप्ति सतह से ली गई हैमापा लागत पर लाभ के भीतर प्रोटीन और intracellular, तनहा प्रोटीन के अनुपात में प्रकट करते हैं. FRAP करने के लिए इसके विपरीत, इस पद्धति के कारण exocytosis वसूली आइसोलेट्स, प्रतिदीप्ति वसूली photobleached क्षेत्र में एक बहुत कम स्तर में जिसके परिणामस्वरूप. कोई विश्वसनीय गणितीय मॉडल की तारीख के लिए फिट और विश्लेषण वसूली इस चयनात्मक विरंजन तकनीक का उपयोग कर दर्ज निशान विकसित किया गया है. लेकिन यह है, संभव वसूली का पता लगाने के लिए एक घातीय वसूली मोनो के साथ फिट: एफ (टी) = एक – एक 0 ई (- टी / τ) जहां F (टी) समय टी में प्रतिदीप्ति है, एक है स्थिर राज्य मूल्य है, एक 0 0 समय ऑफसेट, τ निरंतर समय है. एक संतुलन तक पहुँचने के लिए, सम्मिलन और प्रसार के बीच एक स्थिर राज्य के लिए इसी वसूली वृद्धि दी गई दर के साथ तय हो गई है. महत्वपूर्ण बात है, समय स्थिर यह एक से निकालेnalysis exocytosis के निरंतर समय को प्रतिबिंबित नहीं करता है और केवल एक व्यक्ति प्रोटीन के लिए तुलनात्मक उपचार के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इसके अलावा, प्रतिदीप्ति वसूली की उम्मीद पैटर्न उप डोमेन में photobleached क्षेत्र के साथ मनाया जाने की संभावना है. छोटे एक photobleached खंड के भीतर लागत पर लाभ का विश्लेषण exocytosis "आकर्षण के केंद्र" प्रकट करने के लिए आवश्यक हो सकता है और यह गणना की दर को प्रभावित करेगा dendrite के बीच इन स्थानों के घनत्व की परिवर्तनशीलता के रूप में तुलनीय लंबाई के क्षेत्रों का विश्लेषण करने के लिए सलाह दी जाती है हो सकता है. 3 अंजीर इस प्रोटोकॉल के विस्तार से पता चलता है, देखने के क्षेत्र में कई dendrites के साथ बड़े वर्ग लागत पर लाभ के लिए आवेदन photobleach, केवल एक dendrite के चयनात्मक विरंजन दोहराव के द्वारा पीछा किया. इस दृष्टिकोण के परंपरागत 'FRAP' और 'FRAP फ्लिप' डेटा के समानांतर में प्राप्त किया जा सक्षम बनाता है. इस उदाहरण में, hippocampal न्यूरॉन्स kainate वर्ग के एक ग्लूटामेट रिसेप्टर सबयूनिट के साथ संक्रमित किया गया है; GluK2 सितम्बर टैग. Prioइमेजिंग के लिए आर, इन न्यूरॉन्स (2hrs 200μg/ml पर) cylcohexamide, प्रोटीन संश्लेषण ब्लॉक के साथ इलाज किया गया. , जैसे संबंधित मापा ROIs (3.B छवि) में प्रतिदीप्ति वसूली के रूप में पार्श्व और मानक FRAP dendrite बनाम 'FRAP फ्लिप' प्रोटोकॉल के अधीन dendrite में रीसाइक्लिंग अकेले में प्रसार रीसाइक्लिंग के कारण वसूली के अनुपात से पता चलता है. FRAP बनाम 'FRAP फ्लिप' वसूली घटता, रीसाइक्लिंग के रिश्तेदार योगदान (ΔF आरईसी = 11.05%) की तुलना में पार्श्व प्रसार (ΔF रचनाकार = 9.35%) से ΔF मूल्यों की तुलना inferred किया जा सकता है. चित्रा 2 के विपरीत, वसूली एक स्थिर राज्य बल्कि स्तर, प्रोटीन संश्लेषण के निषेध के कारण बनाए रखने नहीं करता है पता चलता है, एक क्षणिक वृद्धि और उपलब्ध रिसेप्टर पूल (गिरावट लगभग 20% मनाया की कमी के संकेत में ड्रॉप बंद के बाद, इसी रिकॉर्डिंग अवधि में). </p> चित्रा 1 FRAP बनाम FRAP फ्लिप प्रोटोकॉल यह योजनाबद्ध 'FRAP फ्लिप' प्रोटोकॉल की तुलना में एक नियमित FRAP के परिणामों को दिखाता है, सितम्बर – टैग रिसेप्टर्स का उपयोग करने के प्रिंसिपलों के योजनाबद्ध. परंपरागत FRAP में प्रतिदीप्ति वसूली के बाएं हाथ की ओर पर दिखाया गया है. केंद्रीय आरओआई में मापा प्रतिदीप्ति वसूली पार्श्व से photobleached और रीसाइक्लिंग और / या वृक्ष के समान शाफ्ट में डी Novo की exocytosis के माध्यम से रिसेप्टर्स की प्रविष्टि की लागत पर लाभ के बाहर प्रसार गैर photobleached च सितम्बर टैग रिसेप्टर्स की एक संयोजन के लिए जिम्मेदार ठहराया है. इसके विपरीत करके, सही हाथ पक्ष में सचित्र flanking ROIs का दोहराव photobleached से पता चलता है, कि इस बार 'FRAP फ्लिप' प्रोटोकॉल चुप्पी पार्श्व प्रसार के कारण वसूली. जैसे, किसी भी मापा प्रतिदीप्ति वसूली लागत पर लाभ में प्रत्यक्ष प्रविष्टि के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है. चित्रा 2.Sep-GluA2 के वृक्ष के समान शाफ्ट पर प्लाज्मा झिल्ली में सम्मिलन ए) एक hippocampal सितम्बर – GluA2 व्यक्त न्यूरॉन, चुनिंदा dendrite का एक क्षेत्र के साथ photobleached. योजनाबद्ध dendrite का क्षेत्र है जो imaged किया गया है दिखाता है, जबकि ऊपरी बाएँ हाथ पैनल ROIs कि photobleaching के लिए चुना गया है पर प्रकाश डाला गया. बड़े सफेद बॉक्स्ड क्षेत्र एक बार प्रक्षालित किया गया था flanking बॉक्सिंग क्षेत्रों, डबल अध्यक्षता में नीले तीर के साथ प्रकाश डाला विरंजन दोहराव के बाद. इस पैनल dendrite photobleaching के लिए पहले से पता चलता है. लाल तीर मापा लागत पर लाभ, कम पैनल में उच्च वृद्धि में दिखाया इंगित करता है. बी) के प्रयोग के समय के पाठ्यक्रम पर मापा लागत पर लाभ में प्रतिदीप्ति तीव्रता, आरओआई में ग्रे स्तर (नहीं सामान्य) के रूप में साजिश रची से पता चलता है. काला तीर timepoint को उजागर प्रारंभिक photobleach और हरी तीर का दोहराव photobleaching की शुरुआत का संकेत है. ΔF वें इंगित करता हैई वसूली अवधि में मनाया प्रतिदीप्ति में वृद्धि हुई है, Sep-GluA2 के वृक्ष के समान शाफ्ट में सम्मिलन के कारण. बाद कम पीएच और पीएच 7.4 + एनएच 4 सीएल washes की पुष्टि कि बरामद प्रतिदीप्ति व्यक्त रिसेप्टर्स की सतह से संबंधित है. चित्रा 3 पुनर्चक्रण और वृक्ष के समान cyclohexamide उपचार के बाद शाफ्ट पर पार्श्व Sep-GluK2 के प्रसार बनाम पुनर्चक्रण. ) एक एक hippocampal न्यूरॉन के सितम्बर – GluK2 के समानांतर FRAP और FRAP फ्लिप 'वसूली प्रोटोकॉल अलग वृक्ष के समान ROIs के साथ प्रदर्शन के साथ चुनिंदा photobleached व्यक्त. इस न्यूरॉन cyclohexamide साथ pretreatment के अधीन था, प्रोटीन संश्लेषण (200 μg / मिलीलीटर में 2 बजे) ब्लॉक. योजनाबद्ध dendrite का क्षेत्र है जो imaged किया गया है, जबकि बाएं हाथ पैनल ROIs कि photobleaching के लिए चुना गया है पर प्रकाश डाला दिखाता है. गुई बड़े सफेद बॉक्स्ड क्षेत्र एक बार प्रक्षालित किया गया था flanking कम dendrite ही, डबल अध्यक्षता में नीले तीर के साथ प्रकाश डाला बॉक्सिंग क्षेत्रों के दोहराव विरंजन के बाद. इस पैनल में पूर्व photobleaching dendrites से पता चलता है. लाल तीर ROIs बी में उच्च वृद्धि में दिखाया गया) 'FRAP फ्लिप' प्रोटोकॉल बनाम परंपरागत FRAP में प्रतिदीप्ति वसूली illustrating के पर प्रकाश डाला. वसूली की देर चरण (तीसरा पैनल) में प्रतिदीप्ति तीव्रता के स्तर की तुलना पार्श्व और अकेले रीसाइक्लिंग बनाम प्रसार रीसाइक्लिंग के योगदान दिखाने सी) से पता चलता है कि प्रयोग के समय के पाठ्यक्रम पर मापा ROIs में प्रतिदीप्ति तीव्रता, सामान्यीकृत तीव्रता के रूप में साजिश रची मूल्यों. काला तीर timepoint को उजागर प्रारंभिक photobleach और हरी तीर का दोहराव photobleaching की शुरुआत का संकेत है. ΔF आरईसी क्षणिक रिसेप्टर रीसाइक्लिंग के कारण वसूली, dendrite / फ्लिप FRAP से निर्धारित इंगित करता है जबकि ΔFरचनाकार वृक्ष के समान शाफ्ट में केवल FRAP 'लागत पर लाभ में Sep-GluK2 के पार्श्व प्रसार के योगदान उपाय. क्षणिक वृद्धि के संकेत में क्रमिक गिरावट, उपलब्ध रिसेप्टर्स के नीचे cyclohexamide उपचार का एक परिणाम के रूप में चलाने के लिए इसी के द्वारा पीछा किया जाता है. बाद में कम पीएच और पीएच 7.4 + एनएच 4 सीएल washes के पुष्टि करते हैं कि बरामद प्रतिदीप्ति व्यक्त रिसेप्टर्स की सतह से संबंधित है.

Discussion

हम एक अभिनव रणनीति के प्लाज्मा झिल्ली प्रोटीन की तस्करी के घटक कल्पना का वर्णन. सितम्बर टैग प्रोटीन के साथ तकनीक photobleaching की मिश्रित दृष्टिकोण चुनिंदा प्लाज्मा झिल्ली प्रविष्टि घटनाओं मूल्यांकन किया जा करने के लिए सक्षम बनाता है. लगातार वसूली के दौरान flanking क्षेत्रों में झिल्ली प्रोटीन photobleaching, 'FRAP फ्लिप' विधि प्रतिदीप्ति वसूली vesicular तस्करी के योगदान का आकलन है. इस उपन्यास दृष्टिकोण प्रोटीन झिल्ली प्रविष्टि का प्रत्यक्ष रिकॉर्डिंग की अनुमति देता है, सक्षम दोनों उप डिब्बों की संख्या और जहां वसूली मनाया जाता है वसूली (ΔF) के आयाम स्थिर अवस्था में निर्धारित किया है. इसके अलावा, फ्लिप के साथ और बिना FRAP की तुलना वसूली के अनुपात पार्श्व प्रसार करने के लिए गणना की जा करने के लिए attributable की अनुमति देता है.

इसके अलावा, एक ही प्रयोग में, गैर – photobleached dendrite flanking photobleached क्षेत्रों को निकट के क्षेत्रों में हो सकता हैगुणात्मक वसूली के दौरान मूल्यांकन, प्रतिदीप्ति इन क्षेत्रों में मनाया नुकसान dendrite की इन गैर photobleached के क्षेत्रों में photobleached रिसेप्टर्स की पार्श्व प्रसार के कारण हो जाएगा.

इस चयनात्मक photobleaching प्रोटोकॉल के रूप में परिभाषित subareas में प्लाज्मा झिल्ली में excocytosis निस्र्पक (उदाहरण के लिए, dendrites या कांटा) या समानांतर FRAP द्वारा आयोजित पार्श्व प्रसार बनाम प्रविष्टि के योगदान का आकलन करने और FRAP सेलुलर तस्करी प्रक्रियाओं की एक किस्म की जांच करने के लिए उपयोग किया जा सकता है आसन्न dendrites के साथ 'फ्लिप प्रोटोकॉल (3 छवि).

जाहिर है, जबकि विशिष्ट दिशा निर्देशों प्रस्तुत किया गया है, प्रत्येक प्रयोगशाला विशिष्ट नमूनों और उपकरणों के अनुसार इमेजिंग मापदंडों का अनुकूलन की आवश्यकता होगी. महत्वपूर्ण बात है, लागत पर लाभ में सभी सतह रिसेप्टर्स करने के लिए z-अक्ष फोकल हवाई जहाज़ की photobleached, स्वतंत्र है, लेकिन महत्वपूर्ण phototoxic क्षति या गैर विशिष्ट photobleaching के बिना होने की जरूरत है. हमेंनेताओं सावधानी बरतें जब सेल सोम पर अपेक्षाकृत कम पीएच intracellular डिब्बों आम तौर पर इन क्षेत्रों में उच्च पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति में परिणाम के उच्च प्रतिशत के रूप में इस प्रोटोकॉल का प्रयास करना चाहिए,. इसके अलावा, whilst हम दिखा दिया है कि इस तकनीक में लागू किया जा सकता तरीके बदलता है पर चयनात्मक photobleaching प्रयोगों के शुरू करने से पहले, एक नई सितम्बर टैग निर्माण, हम सलाह है कि टैग रिसेप्टर्स की एक प्रारंभिक लक्षण वर्णन पहले आयोजित किया जाता है एश्बी एट अल द्वारा के रूप में वर्णित ^2.

कुल मिलाकर, इस विधि मानक FRAP प्रोटोकॉल का एक शक्तिशाली और बहुमुखी अनुकूलन है, सक्षम प्लाज्मा झिल्ली में सम्मिलन घटनाओं के पास वास्तविक समय में मूल्यांकन किया जाना है.

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
24mm glass coverslips	VWR International	631-0161
Poly-l-lysine	Sigma	P2636	1mg/ml in borate buffer to coat coverslips
Neurobasal Medium	Invitrogen	21103
B27	Invitrogen	17504-044	2% in neuronal plating and feeding medium
Penicillin Streptomycin	Sigma	P0781	1% in neuronal plating and feeding medium
L-Glutamine	Invitrogen	25030	2mM / 0.8mM in plating/feeding medium
Horse Serum	Biosera	DH-291H	10% in neuronal plating media only
pSIN ReP5 cloning vector	Invitrogen	K75001	For Sindbis virus production
LSM510 META confocal system	Zeiss
Image J Software	NIH		open access software. All plugins described herein are available at http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/