Die Methode beschreibt das Verfahren, mit dem die Hawaiian Bobtail Squid, Euprymna scolopes Und ihre bakteriellen Symbionten, Vibrio fischeri, Werden getrennt und dann eingeführt werden, um für spezifische Besiedlung des Tintenfisches Lichtorgel von den Bakterien ermöglichen angehoben. Colonization Erkennung von Bakterien stammende Lumineszenz und durch direkte Auszählen von Kolonien werden beschrieben.
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Methodenartikel
Colonization von Euprymna scolopes Squid durch Vibrio fischeri
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Spezielle Bakterien werden in Zusammenarbeit mit tierischem Gewebe 1-5 gefunden. Solche Wirt-Bakterien-Assoziationen (Symbiosen) kann schädlich sein (pathogene), haben kein Fitness-Folge (Kommensalen), oder von Vorteil sein (mutualistic). Während viel Wert wurde auf pathogene Interaktionen gegeben wurde, ist wenig über die Prozesse, die die reproduzierbare Erfassung von nützlichen / symbiotischer Bakterien aus der Umwelt zu diktieren bekannt. Die Lichtorgan Mutualismus zwischen der marinen Gram-negative Bakterium V. fischeri und die hawaiianische Bobtail Tintenfisch, E. scolopes, stellt eine sehr spezifische Interaktion, in denen ein Wirt (E. scolopes) stellt eine symbiotische Beziehung mit nur einer Bakterienart (V. fischeri) im Laufe seiner Lebensdauer 6,7. Biolumineszenz von V. produziert fischeri in dieser Interaktion ist daher ein Anti-Verdrängung Vorteil E. scolopes bei nächtlichen Aktivitäten 8,9, währenddas nährstoffreiche Wirtsgewebe stellt V. fischeri mit einer geschützten Nische 10. Während jeder Host-Generation wird diese Beziehung rekapituliert und damit zu einer vorhersehbaren Prozess, der im Detail in verschiedenen Stadien der Entwicklung symbiotische beurteilt werden kann. Im Labor der Jugendliche Tintenfisch Luke aposymbiotically (unbesiedelten), und, wenn innerhalb der ersten 30-60 Minuten gesammelt und an Symbionten-freies Wasser, kann nur durch die experimentelle Inokulum 6 besiedelt werden. Diese Wechselwirkung bietet daher ein nützliches Modell, bei dem die einzelnen Schritte, die für bestimmte Erwerb einer symbiotischen Mikroben aus der Umgebung 11,12 führen zu bewerten.
Hier beschreiben wir eine Methode, um den Grad der Kolonisierung, die beim neu geschlüpften aposymbiotic E. tritt bewerten scolopes werden (künstliche) mit Meerwasser ausgesetzt V. fischeri. Dieser einfache Test beschreibt Inokulation natürlichen Infektion und Erholungder bakteriellen Symbionten aus dem im Entstehen begriffenen Lichtorgel von E. scolopes. Es wird darauf geachtet, um eine konsistente Umgebung für die Tiere während symbiotische Entwicklung zu sorgen, insbesondere im Hinblick auf die Wasserqualität und Licht Cues. Methoden, um die symbiotische Bevölkerung beschrieben charakterisieren, gehören (1) Messung von Bakterien stammende Biolumineszenz, und (2) direkte Zählung der Kolonie erholte Symbionten.
Protokoll
1. Zubereitung von bakteriellen Inokula
- Tag 0
Zwei Tage vor der Impfung Tintenfisch, Teller die relevanten Bakterienstämme auf 13 LBS-Agar. - Inkubieren Bakterien bei 25-28 ° C über Nacht.
- Tag 1
Beimpfen 3 ml LBS-Medium in einem Glas Kultur Rohr mit einer Kolonie von jedem V. fischeri Belastung für eine Infektion. Bereiten Sie doppelte Röhren als Backup. - Tag 2
(Koordinieren bakteriellen 1,4-1,6 Schritten mit Tintenfisch Schritten von 3,7 bis 3,10)
1 h vor der Inokulation, Subkultur Bakterien 1:80 (37,5 ul) in 3 ml ....
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Diskussion
Die Kolonisierung beschriebene Assay ermöglicht die Analyse einer natürlichen symbiotischen Prozess, in einer kontrollierten Laborumgebung. Als solche kann sie verwendet werden, um die Besiedlung durch Mutantenstämmen, die von verschiedenen natürlichen Isolaten und unter unterschiedlichen chemischen Regime zu beurteilen. Variationen der beschriebenen Experimente werden üblicherweise verwendet, um verschiedene Aspekte der Symbiose zu bewerten. Die Kinetik der Kolonisierung ist anhand von Lichtemission während der ersten .......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Danksagungen
Die Autoren bedanken sich Mattias Gyllborg für Kalmare von Einrichtungen zur Förderung und für Kommentare zu diesem Manuskript, Michael Hadfield und die Kewalo Marine Laboratory für die Unterstützung während der Bereich Sammlung, und Mitgliedern der Ruby und McFall-Ngai Labor für Beiträge zu diesem Protokoll. Arbeit in der Mandel-Labor ist von der NSF IOS-0843633 gefördert.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Name des Reagenz | Firma | Katalog-Nummer | Kommentare |
| Glass Kultur Tubes, 16 mm Durchmesser | VWR | 47729-580 | |
| Caps für Kultur Glass Tubes | Fischer | NC9807998 | |
| Visible Spektralphotometer zur Bestimmung der OD 600 | Biowave | CO8000 | Jede Spektrophotometer für die Messung OD 600 funktionieren wird. Dieses Gerät kann die OD 600 von Flüssigkeit direkt zu messen in der Glas-Kulturröhrchen. Einige Einstellung des Inokulums Berechnung kann erforderlich sein, je nach dem verwendeten Instrument. |
| GloMax 20/20 Einzel-Tube Luminometer | Promega | E5311 | Entspricht der Turner BioSystems 20/20n Luminometer. Enthält die Mikrozentrifugenröhrchen Halter. |
| GloMax 20/20 Light Standard | Promega | E5341 | Für Luminometer Kalibrierung. |
| Refraktometer, Handheld | Foster and Smith Wassersport | CD-14.035 | Kalibrieren Sie vor jedem Gebrauch mit entionisiertem Wasser. Spülen Sie nach jedem Gebrauch mit deionisiertem Wasser auf Salz zu verhindern Aufbau. |
| Instant Ocean (künstlichem Meerwasser-Konzentrat) | Foster & Smith Wassersport | CD-16.881 | Bereiten Sie bei 35 ‰ in VE-Wasser, mit dem Refraktometer, filtriert dann über einen 0,2 um Filter SFCA. |
| Filtrationseinheit | Nalgene | 158-0020 | Tensidfreie Celluloseacetat (SFCA)-Membran, 0,2 um. Wir haben unterschiedliche Ergebnisse mit einigen tensidhaltigen PES Filter beobachtet. |
| Transferpipetten | Fischer | 13-711 -09.00 Uhr | Mit einer Schere oder Rasierklinge, schneiden Sie die Spitze sauber über dem ersten Grat, den Durchmesser der Pipettenspitze zu erhöhen und zu vermeiden Zusammendrücken der Tintenfisch Schlüpflinge. |
| Einweg Probeschälchen (Plastikbechern) | Komet | Von T9 (9 oz.) | Schalen für die Impfung, mit oberer Durchmesser 3 ¼ ", unterer Durchmesser 2 ¼", Höhe 3 ". Bowls schaffen eine homogene Umgebung, da sie keinen unteren Rand, in dem Tintenfisch in einer sauerstoffarmen Nische gefangen nicht bekommen können. Die Größe wird optimiert für 40-ml Inokulum. Verfügbar unter webstaurantstore.com, # 619PI9. |
| Drosophila-Vials | VWR | 89092-720 | Vial Durchmesser entspricht der Öffnung auf dem Luminometer PMT. |
| 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen | ISC Bioexpress | C-3217-1CS | Rohre müssen passen die Form der Stößel. |
| Ethanol, 200 Proof | Fischer | BP2818-100 | |
| Pistille | Kimble Chase / Kontes | 749521-1500 | |
| Plating Perlen, 5 mm Durchmesser | Kimble Chase | 13500 5 | Bereiten Sie 5 pro Rohr und Autoklaven. |
Referenzen
- Aas, J. A., Paster, B. J., Stokes, L. N., Olsen, I., Dewhirst, F. E. Defining the normal bacterial flora of the oral cavity. J. Clin. Microbiol. 43, 5721-5732 (2005).
- Mandel, M. J., Wollenberg, M. S., Stabb, E. V., Visick, K. L., Ruby, E. G. A single regulatory gene is sufficient to alter bacte....
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Nachdrucke und Genehmigungen
