Den kinetochore er der SAC innleder sitt signal overvåke mitotiske segregering av søsterkromatider. En metode er beskrevet for å visualisere rekruttering og omsetning av en av de kinetochore proteiner og koordinering med kromosom bevegelse i<em> Drosophila</em> Embryo ved hjelp av en Leica laserskanning confocal system.
Spindelen forsamlingen sjekkpunkt (SAC) mekanismen er en aktiv signal, som overvåker samspillet mellom kromosom kinetochores og spindel mikrotubuli å hindre anaphase utbruddet til kromosomene er riktig tilkoblet. Celler bruker denne mekanismen for å forhindre Aneuploidy eller genomisk ustabilitet, og dermed kreft og andre sykdommer hos mennesker som fødselsskader og Alzheimers 1. En rekke av de SAC komponenter som Mad1, Mad2, Bub1, BubR1, Bub3, Mps1, Zw10, har Rod og Aurora B kinase blitt identifisert og de er alle kinetochore dynamiske proteiner to. Tyder på at kinetochore er der SAC signalet er igangsatt. Den SAC Prime regulatoriske målet er Cdc20. Cdc20 er en av de grunnleggende APC / C (A naphase P romoting C omplex eller C yclosome) aktivatorer 3 og er også en kinetochore dynamisk protein 4-6. Når aktivert, hemmer SAC aktiviteten i APC / C for å hindre ødeleggelse av to viktige substrater, cyclin B og securin, og hindrer dermed metafase til anaphase overgangen 7,8. Nøyaktig hvordan SAC signalet er initiert og montert på kinetochores og videreformidlet på APC / C for å hemme sin funksjon likevel fortsatt ukjent.
Drosophila er en ekstremt medgjørlig eksperimentelt system, en mye enklere og bedre forstått organisme i forhold til den menneskelige, men en som deler fundamentale prosesser i felles. Det er kanskje en av de beste organismer til bruk for bio-imaging studier i levende celler, spesielt for visualisering av mitotiske hendelsene i rom og tid, som den tidlige embryoet går gjennom 13 raske kjernefysiske divisjon sykluser synkront (8-10 minutter for hver syklus ved 25 ° C) og gradvis organiserer kjerner i én monolayer like under cortex 9.
Her presenterer jeg en bio-imaging-metoden bruker transgene Drosophila uttrykksing GFP (grønt fluorescerende protein) eller dets variant målrettede proteiner av interesse og en Leica TCS SP2 confocal laserskanning mikroskop for å studere SAC-funksjonen i fluer, ved å vise bilder av GFP fusjon proteiner av noen av de SAC komponenter, Cdc20 og Mad2 , som eksempel.
Protokollen er beskrevet her er en generisk metode for avbildning fly syncytial embryo ved hjelp av en Leica TCS SP2 confocal laserskanning mikroskop og kan bli endret for å passe andre mikroskop systemer, og kan også tilpasses til å studere andre genet funksjoner ved hjelp av Drosophila syncytial embryoer. Vi har brukt denne protokollen til å studere mange aspekter av spindelen forsamlingen sjekkpunkt, protein dynamikk og protein proteolyse bruker transgene fluer eller polyklonale antistoffer til å visualisere protein lokalisering i levende eller faste prøver 4,6,12-14.
Det enkleste er å holde fluene i ferske fluefiskere mat ampuller ved innsamling små tall (~ 10 – 100) av egg. Dette reduserer stresset med å lage og forberede ytterligere eplejuice agar plater og egg samling kamre som beskrevet i andre publikasjoner 15,16. Tillegg av en liten firkant av knust dekkglass glass i den ene enden av lim stripe på dekkglass gjør det mye enklereå åpne nålen og bestemme injeksjonsvolum ved å justere mikroinjeksjon systeminnstillingene mens nålen er fordype i 10S olje. Graden av uttørking av embryo er viktig for suksessen til injeksjon for å unngå lekkasjer og vedlikehold av embryoer levedyktighet spesielt for de eksperimentene som krever en lang periode eller når heve transformants etter injeksjon. Men det er ingen gylden regel for hvor lenge uttørking er nødvendig. Dette varierer fra eksperiment til eksperiment og avhenger av mengden av løsningen injisert og fuktigheten av arbeidsmiljøet.
Funksjonene til et bestemt protein av interesse kan manipuleres av microinjecting bestemt protein-hemmere, mono-eller poly-klonal antistoffer mot et bestemt protein, messenger RNA eller fluorescensmerkede peptider henhold villtype eller genetisk mutasjon bakgrunn. Mange av disse muterte linjer eller GFP-merkede transgene linjer er offentlig AVailable fra Drosophila lager sentre og de fleste av dem er notert på Flybase ( http://flybase.org/~~V ) og kan søkes på nettet.
The authors have nothing to disclose.
Denne protokollen ble utviklet under et Wellcome Trust stipend. Vi takker Ms Maureen Sinclair for å opprettholde flua bestander og forberede flua mat gjennom årene. Vi ønsker også å takke Mr. Michael Aitchison for hans hjelp og teknisk støtte i utviklingen av denne protokollen.
Essential equipment and reagents:
Confocal imaging system: The imaging system described in this protocol is a Leica TCS SP2 laser scanning confocal inverted microscope system. The method described is also suitable perhaps with some minor modifications for other imaging systems.
Dissecting microscope: We use an Olympus SZX7 with DF PLAPO 1X-4 lens.
Needle puller: Flaming/brown micropipette puller (from Sutter Instrument, Model: P-97).
Microinjection system: An Eppendorf microinjection system is described but any other appropriate system can be used.
Fly food distributor: Jencons Scientific Ltd peristaltic pump.
Reagents:
Ingredients | Weights | Resources | Lot No. |
Maize meal | 100.0g | SUMA, UK | |
Brown sugar | 50.0g | Billington’s, UK | |
Dry yeast | 25.0g | DCL YEAST Ltd. UK | |
Agar | 12.5g | Fisher Scientific | 106556 |
Sorbic acid | 0.4g | BDH, VWR International Ltd. UK | 8829310 |
Benzoic acid | 2.9g | Fisher Scientific | 1019599 |
Nipagin (Methyl -4-Hydro xybenzoate) |
0.9g | BDH, VWR International Ltd. UK | K35969015 |
H2O up to 1L |
Table 1. Fly food ingredients.
Holocarbon 700 and 27 oils purchased from Sigma.
Dry yeast: Thomas Allison, UK.
Preparing the heptane glue: Take about 1.5 meters of double-sided Scotch tape, put it into a 15ml Falcon tube with 5ml of heptane and rotate for 3-5 hours or overnight. After that time split into 4 equal aliquots in 1.5 ml eppendorf centrifuge tubes and spin for 5 min at a fast speed in a bench-top centrifuge to remove any debris. Store the heptane glue solution in a 10ml volumetric flask and keep for use. The glue strength will vary according to the concentration and the amounts of the glue used. Normally, the thinner glue produces lesser noisy background when scanned by confocal microscope.