Thiol redox आइसोटोप टैगिंग मास स्पेक्ट्रोमेट्री proteome रूपरेखा
Summary
प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों स्तर जब कोशिकाओं को तनाव की स्थिति का सामना करने के लिए उठाया है. यहाँ हम '3'-3 diaminobenzidine धुंधला के उदाहरण के रूप में के रूप में अच्छी तरह से cysTMT लेबलिंग और मास स्पेक्ट्रोमेट्री में redox proteome प्रोफ़ाइल के दिखा<em> स्यूडोमोनास syringae</em> टमाटर पत्तियों का इलाज.
Abstract
Pseudomonas syringae pv. tomato strain DC3000 not only causes bacterial speck disease in Solanum lycopersicum but also on Brassica species, as well as on Arabidopsis thaliana, a genetically tractable host plant1,2. The accumulation of reactive oxygen species (ROS) in cotyledons inoculated with DC3000 indicates a role of ROS in modulating necrotic cell death during bacterial speck disease of tomato3. Hydrogen peroxide, a component of ROS, is produced after inoculation of tomato plants with Pseudomonas3. Hydrogen peroxide can be detected using a histochemical stain 3′-3′ diaminobenzidine (DAB)4. DAB staining reacts with hydrogen peroxide to produce a brown stain on the leaf tissue4. ROS has a regulatory role of the cellular redox environment, which can change the redox status of certain proteins5. Cysteine is an important amino acid sensitive to redox changes. Under mild oxidation, reversible oxidation of cysteine sulfhydryl groups serves as redox sensors and signal transducers that regulate a variety of physiological processes6,7. Tandem mass tag (TMT) reagents enable concurrent identification and multiplexed quantitation of proteins in different samples using tandem mass spectrometry8,9. The cysteine-reactive TMT (cysTMT) reagents enable selective labeling and relative quantitation of cysteine-containing peptides from up to six biological samples. Each isobaric cysTMT tag has the same nominal parent mass and is composed of a sulfhydryl-reactive group, a MS-neutral spacer arm and an MS/MS reporter10. After labeling, the samples were subject to protease digestion. The cysteine-labeled peptides were enriched using a resin containing anti-TMT antibody. During MS/MS analysis, a series of reporter ions (i.e., 126-131 Da) emerge in the low mass region, providing information on relative quantitation. The workflow is effective for reducing sample complexity, improving dynamic range and studying cysteine modifications. Here we present redox proteomic analysis of the Pst DC3000 treated tomato (Rio Grande) leaves using cysTMT technology. This high-throughput method has the potential to be applied to studying other redox-regulated physiological processes.
Protocol
Discussion
इस प्रोटोकॉल एक थपका धुंधला प्रदर्शन पर जानकारी के cysTMT लेबल redox सिस्टीन मात्रा का ठहराव के रूप में के रूप में अच्छी तरह से प्रदान करता है. इन प्रक्रियाओं ROS के उत्पादन के रूप में अच्छी तरह के रूप में प्रोटीन विनियमन कि जब रक्तवृतांक्त स्यूडोमोनास syringae साथ inoculated है पर प्रभाव की जांच करने में फायदेमंद होते हैं. इस प्रोटोकॉल में प्रस्तुत तरीकों पूरी पत्ती के नमूने में एक तरीका है कि पत्ता ऊतक को नुकसान के कम से कम राशि का कारण बनता है में ROS की जांच के लिए एक तरीका प्रदान करते हैं. लेबलिंग प्रक्रिया करने के लिए एक एक सिस्टीन लेबलिंग विधि के उपयोग द्वारा संभावित redox विनियमित प्रोटीन की जांच करने के लिए एक तरीका प्रदान करता है. यह फायदेमंद है, जब तनाव प्रतिक्रिया का एक प्रारंभिक चरण की जांच.
आइसोटोप कोडित संबंध (ICAT) टैग और cysTMT के तरीके के रूप में जैविक नमूनों में संभावित redox विनियमित प्रोटीन की जांच में इस्तेमाल किया जा सकता है. ICAT लेबलिंग और दो 12 नमूनों की तुलना की अनुमति देता है. दोनों तरीकों मुक्त cysteines लेबल और quantific प्रोटीन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है10,12 समझना. हालांकि, cysTMT विधि प्रयोगात्मक विभिन्नता में कमी के रूप में के रूप में अच्छी तरह से 10 बहुसंकेतन के लिए अनुमति देता है. टैग की संख्या में उपलब्ध के शोधकर्ताओं प्रतिकृति या उनके प्रयोगात्मक डिजाइन में कई नमूने शामिल करने के लिए अनुमति देता है. अधिक नमूनों के बाद पहचान प्रोटीन के एक उच्च संख्या के लिए क्षमता प्रदान करता है. CysTMT तकनीक का एक बड़ा नुकसान है कि यह लेबल पेप्टाइड्स (6.5-6.6) cysTMT के लिए चयनात्मक संवर्धन कदम की वजह से प्रोटीन की पहचान की समग्र गुणवत्ता से समझौता है. प्रोटीन की पहचान के लिए पेप्टाइड्स की संख्या प्रोटीन अनुक्रम में सिस्टीन अवशेषों की संख्या पर काफी हद तक निर्भर करता है. संवर्धन से पहले मास स्पेक्ट्रोमेट्री प्रोटीन की पहचान के लिए का हिस्सा tryptic नमूना प्रस्तुत करने के द्वारा इस समस्या को दूर किया जा सकता है.
प्रयोगात्मक डिजाइन के रूप में के रूप में अच्छी तरह से लेबल तंत्र कि cysTMT विधि का इस्तेमाल प्रकृति के कारण, कुछ महत्वपूर्ण कदम हैं. जबकि प्रोटीन preci प्रदर्शनpitation और गोली धोने (3.9) प्रोटीन गिरावट को कम करने के लिए बर्फ पर ठंडा नमूने रखने के लिए महत्वपूर्ण है. CysTMT लेबलिंग के दौरान कम करने अभिकर्मक (4.6) को हटाने के महत्वपूर्ण है क्योंकि नमूने रिवर्स लेबलिंग से गुजरना सकता है. रिवर्स लेबलिंग संभव है अगर अभिकर्मक को कम करने के नमूने में रहता है. यदि नमूने लेबलिंग के बाद कम कर रहे हैं, cysTMT टैग हटाया जा सकता है. एक बार लेबल नमूने के लिए जोड़ रहे हैं, पीएच स्तर (4.7) की जाँच की जानी चाहिए ताकि इष्टतम लेबलिंग दक्षता है. इसके अलावा, डेटा विश्लेषण क्या शोधकर्ता और प्रोटोकॉल का उपयोग कर में अंतिम लक्ष्य के लिए जरूरी है पर निर्भर है. यह भी इस्तेमाल किया जा रहा है के रूप में प्रत्येक सॉफ्टवेयर विभिन्न एल्गोरिदम सॉफ्टवेयर पर निर्भर है.
टमाटर में प्रतिक्रियाशील oxidative प्रजातियों में से बढ़ाया उत्पादन के लिए एक elicitor के रूप में यह प्रयोग रोगज़नक़ का इस्तेमाल, तथापि, अन्य redox विनियमित प्रतिक्रियाओं के अनुसार मापा जा सकता है. इस प्रयोगात्मक डिजाइन अन्य संयंत्र और जानवर सिस्टम के लिए अनुकूलनीय है. </p>
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों लिए DC3000 तनाव, टमाटर के बीज, और सलाह प्रदान करने के लिए डा. ग्रेग मार्टिन (कार्नेल विश्वविद्यालय) और उनके समूह को धन्यवाद देना चाहूंगा. उन्होंने यह भी करने के लिए धन्यवाद डा. Zhonglin थपका और UF विधि विकास में सहायता के लिए जैव प्रौद्योगिकी अनुसंधान के लिए अंतःविषय केंद्र पर प्रोटिओमिक्स डिवीजन प्रोटोकॉल के साथ मदद के लिए समझौता ज्ञापन करना चाहते हैं. प्रोटीन निष्कर्षण के लिए प्रोटोकॉल Hurkman और तनाका 16 से संशोधित किया गया था. 6 cysTMT लेबलिंग, 4 कदम पर प्रोटोकॉल मूल पियर्स थर्मो फिशर साइंटिफिक 17 पुस्तिका उत्पाद पर आधारित अनुकूलित किया गया. यह काम राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (MCB 0,818,051 एस चेन के लिए) द्वारा वित्त पोषित किया गया.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| MetroMix 500 | BWI Companies | TX-500 |
| 3,3′-Diaminobenzidine | Sigma-Aldrich | D8001 |
| ReadyPrep Sequential Extraction kit Reagent 3 | Bio-Rad | 163-2104 |
| CB-X protein assay | Geno Technology | 786-12x |
| cysTMT reagents | Thermo Scientific Pierce Protein Research Products | 90071 |
| Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 161-0737 |
| Bio-Safe Comassie (G-250 stain) | Bio-Rad | 161-0786 |
| Microcon 3KD column | Millipore | 42403 |
| Immobilized Anti-TMT resin | Thermo Scientific Pierce Protein Research Products | 90076 |
| Centrifuge column | Thermo Scientific Pierce Protein Research Products | 89896 |
| Proteopep II C18 column | New Objective | PFC7515-PP2-10 |
| NanoLC-1D HPLC | AB Sciex | 90389 |
| LTQ Orbitrap XL | Thermo Scientific | 0020137580 |
| SpeedVac | Labconco | 7812013 |
| Proteome Discoverer 1.2 software | Thermo Scientific Pierce Protein Research Products | |
| Trypsin | Promega | V5111 |
| Oakridge Centrifuge Tube | Thermo Scientific Nalgene Company | 3139-0050 |
| Microcentrifuge tube (2ml) | USA Scientific | 1620-2700 |
| 12% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel | Bio-Rad | 456-1043 |
| Top of Form >Bio-Safe Coomassie StainBottom of Form |
Bio-Rad | 161-0786 |
| TMT enrichment kit | Thermo Scientific Pierce Protein Research Products | 90077 |
References
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