Reaktiva syrespecies-nivån är förhöjd när celler möter stressförhållanden. Här visar vi som exempel 3'-3 'diaminobensidin färgning liksom cysTMT märkning och masspektrometri för att profilera redox proteomanalys i<em> Pseudomonas syringae</em> Behandlades tomatblad.
Pseudomonas syringae pv. Planta DC3000 inte bara orsakar bakteriell fläck sjukdom i Solanum lycopersicum utan även på Brassica-arter, såväl som på Arabidopsis thaliana, en genetiskt foglig värdväxt 1,2. Ackumuleringen av reaktiva syrespecies (ROS) i kotyledoner inokulerade med DC3000 indikerar en roll för ROS vid modulering nekrotisk celldöd under bakteriell sjukdom fläck av tomat 3. Väteperoxid, en komponent av ROS, framställs efter inokulering av tomatplantor med Pseudomonas 3. Väteperoxid kan detekteras med användning av en histokemisk färgning 3'-3 'diaminobensidin (DAB) 4. DAB-färgning reagerar med väteperoxid för att producera en brun fläck på bladvävnad 4. ROS har en reglerande roll av den cellulära redox miljön, vilket kan ändra redox status för vissa proteiner 5. Cystein är en viktig aminosyra känslig förredox förändringar. Under mild oxidation, tjänar reversibel oxidation av cystein sulfhydrylgrupper såsom redox sensorer och omformare signal som reglerar ett flertal fysiologiska processer 6,7. Tandemmasspektrometri tagg (TMT) reagens möjliggör samtidig identifiering och multiplexeras kvantifiering av proteiner i olika prov med användning av tandemmasspektrometri 8,9. De cystein-reaktiva TMT (cysTMT) reagens möjliggör selektiv märkning och relativ kvantifiering av cystein-innehållande peptiderna från upp till sex biologiska prover. Varje isobarisk cysTMT tagg har samma nominella modermassan och är sammansatt av en sulfhydryl-reaktiv grupp, en MS-neutralt spacerarm och en MS / MS-reportern 10. Efter märkning proverna föremål för proteasklyvning. De cystein-märkta peptider anrikades med användning av en harts innehållande anti-TMT-antikropp. Under MS / MS-analys, en serie reporter joner (dvs 126-131 Da) dyker upp i den låga massan regionen med information om relativ kvantifiering.Arbetsflödet är effektiv för att minska urvalet komplexiteten, förbättra dynamiskt omfång och studera cystein ändringar. Här presenterar vi redox proteomic analys av Pst behandlade DC3000 tomat (Rio Grande) lämnar hjälp cysTMT teknik. Detta högeffektiv metod har potentialen att användas för att studera andra redox-reglerade fysiologiska processer.
Detta protokoll innehåller information om DAB färgning samt cysTMT märkta redox cystein kvantifiering. Dessa förfaranden är till nytta för att undersöka produktion av ROS samt effekt på protein reglering när Solanum lycopersicum ympas med Pseudomonas syringae. De metoder som presenteras i detta protokoll är ett sätt att undersöka ROS i hela bladprover på ett sätt som orsakar minsta skada på bladvävnad. Märkningen Förfarandet ger ett sätt att undersöka potentiellt redox regleras proteiner genom att använda en metod cystein märkning. Detta är fördelaktigt när man undersöker ett tidigt skede av stress.
Metoder som isotop-kodad affinitetsmarkör (ICAT) och cysTMT kan användas för att avgöra eventuella redox reglerade proteiner i biologiska prover. ICAT gör märkning och jämförelse av två prover 12. Båda metoderna märka fria cysteiner och kan användas för protein quantification 10,12. Emellertid tillåter cysTMT metod för en minskning i experimentell variation liksom multiplexering 10. Antalet taggar tillgängliga möjligt för forskare att ta replikerar eller flera prover i sin experimentella design. Med fler prover ger möjlighet för ett större antal identifierade proteiner. En stor nackdel med den cysTMT teknik är att den äventyrar den totala kvaliteten av proteinidentifiering grund av den selektiva anrikningen stegen för cysTMT märkta peptider (6,5-6,6). Antalet peptider för proteinidentifiering beror till stor del på antalet cysteinrester i proteinsekvensen. Detta problem kan övervinnas genom att lämna en del av den tryptiska provet före anrikning för masspektrometri proteinidentifiering.
På grund av karaktären av den experimentella utformningen såväl som märkning mekanism som den cysTMT metod utnyttjar vissa steg är kritiskt. Medan du utför protein precisionpitation och pellets tvättar (3,9) är det viktigt att hålla prover kylas på is för att minska proteinnedbrytning. Under cysTMT märkning är avlägsnande av reduktionsmedel (4,6) viktig, eftersom prover kan genomgå omvänd märkning. Omvänd märkning är möjlig om reduktionsmedel kvar i provet. Om proverna reduceras efter märkning, kan cysTMT taggen avlägsnas. När väl etiketten sätts till proverna, måste pH-värdet kontrolleras (4,7) för att få optimal märkning effektivitet. Dessutom är dataanalys beror på vad som krävs av forskaren och det slutliga målet att använda protokollet. Det är också beroende av programvara som används som varje program har olika algoritmer.
Detta experiment använder patogen som elicitor för ökad produktion av reaktiva oxidativa arter i tomat, men kan andra redox reglerade svar mätas i enlighet därmed. Denna experimentella designen kan anpassas till andra anläggningar och system djur. </p>
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka Dr Greg Martin (Cornell University) och hans grupp för att tillhandahålla DC3000 stammen, frön tomat och råd. De skulle också vilja tacka Dr Zhonglin Mou för hjälp med DAB protokollet och Proteomics Division på UF tvärvetenskapligt centrum för bioteknik Forskning för stöd i metodutveckling. Protokollet för proteinextraktion ändrades från Hurkman och Tanaka 16. Protokollet om cysTMT märkning, steg 4 till 6 har anpassats baserat på den ursprungliga Thermo Pierce Fisher Scientific produkthandboken 17. Detta arbete har finansierats av National Science Foundation (MCB 0.818.051 till S Chen).
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
MetroMix 500 | BWI Companies | TX-500 |
3,3′-Diaminobenzidine | Sigma-Aldrich | D8001 |
ReadyPrep Sequential Extraction kit Reagent 3 | Bio-Rad | 163-2104 |
CB-X protein assay | Geno Technology | 786-12x |
cysTMT reagents | Thermo Scientific Pierce Protein Research Products | 90071 |
Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 161-0737 |
Bio-Safe Comassie (G-250 stain) | Bio-Rad | 161-0786 |
Microcon 3KD column | Millipore | 42403 |
Immobilized Anti-TMT resin | Thermo Scientific Pierce Protein Research Products | 90076 |
Centrifuge column | Thermo Scientific Pierce Protein Research Products | 89896 |
Proteopep II C18 column | New Objective | PFC7515-PP2-10 |
NanoLC-1D HPLC | AB Sciex | 90389 |
LTQ Orbitrap XL | Thermo Scientific | 0020137580 |
SpeedVac | Labconco | 7812013 |
Proteome Discoverer 1.2 software | Thermo Scientific Pierce Protein Research Products | |
Trypsin | Promega | V5111 |
Oakridge Centrifuge Tube | Thermo Scientific Nalgene Company | 3139-0050 |
Microcentrifuge tube (2ml) | USA Scientific | 1620-2700 |
12% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel | Bio-Rad | 456-1043 |
Top of Form >Bio-Safe Coomassie StainBottom of Form |
Bio-Rad | 161-0786 |
TMT enrichment kit | Thermo Scientific Pierce Protein Research Products | 90077 |