Simple Dispositifs microfluidiques pour<em&gt; In vivo</em&gt; Imagerie des<em&gt; C. elegans</em&gt;,<em&gt; Drosophila</em&gt; Et le poisson-zèbre

Sudip Mondal; Shikha Ahlawat; Sandhya P. Koushika

doi:10.3791/3780

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Article de méthode

Simple Dispositifs microfluidiques pour

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DOI :

10.3791/3780

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30 septembre 2012

Sudip Mondal¹ , Shikha Ahlawat¹ , Sandhya P. Koushika¹^,²

¹Neurobiology, NCBS-TIFR, ²Department of Biological Sciences, TIFR

Dans cet article

Résumé

Un dispositif simple microfluidique a été développé pour effectuer anesthésie gratuit In vivo Imagerie de C. elegans, Intact Drosophila Larves et des larves de poisson zèbre. Le dispositif utilise une membrane déformable PDMS pour immobiliser ces organismes modèles pour effectuer une imagerie laps de temps de nombreux procédés tels que battement de coeur, la division cellulaire et subcellulaire de transport neuronale. Nous démontrons l'utilisation de cet appareil et de montrer des exemples de différents types de données collectées à partir des systèmes de modèles différents.

Résumé

Micro fabriqués dispositifs fluidiques fournir un accès micro-environnement pour les études in vivo sur de petits organismes. Procédés de fabrication simples sont disponibles pour dispositifs microfluidiques utilisant des techniques de lithographie douce ^1-3. Dispositifs microfluidiques ont été utilisés pour les sous-imagerie cellulaire ^4,5, in vivo microchirurgie au laser et imagerie cellulaires ^{2,6 4,7.} L'imagerie in vivo nécessite l'immobilisation des organismes. Ceci a été réalisé en utilisant une aspiration ^{5,8, 6,7,9} canaux coniques, des membranes déformables, ^2-4,10 aspiration avec refroidissement supplémentaire ^5, gaz anesthésique ^11, gels sensibles à la température ^{12, 13} et colle cyanoacrylate anesthésiques tels que le lévamisole ^{14 , 15.} Anesthésiques couramment utilisés influencer la transmission synaptique ^16,17 et sont connus pour avoir des effets néfastes sur la sous-cellulaire ⁴ transport neuronal. Dans cette èreudy nous démontrons une membrane à base de poly-diméthyl-siloxane (PDMS) dispositif qui permet l'immobilisation sans anesthésie intactes organismes modèles génétiques telles que Caenorhabditis elegans (C. elegans), larves de drosophile et les larves de poisson zèbre. Ces organismes modèles sont adaptés pour des études in vivo dans des dispositifs microfluidiques en raison de leurs faibles diamètres et des organismes optiquement transparents ou translucides. Diamètres de corps vont de ~ 10 um à 800 um ~ pour les premiers stades larvaires de C. larves elegans et le poisson zèbre et nécessitent des dispositifs microfluidiques de tailles différentes pour atteindre une immobilisation complète pour la résolution imagerie time-lapse élevé. Ces organismes sont immobilisés en utilisant la pression appliquée par l'azote gazeux comprimé à travers une colonne de liquide et imagée à l'aide d'un microscope inversé. Animaux libérés du piège de revenir à la locomotion normale dans les 10 min.

Nous démontrons quatre applications imagerie time-lapse en C. elegansnommément imagerie mitochondriale de transport dans les neurones, le transport vésiculaire présynaptique dans un transport défectueux mutant, le transport des récepteurs du glutamate et de la division cellulaire Q neuroblastes. Les données obtenues à partir de ces films montrent que l'immobilisation microfluidique est un moyen utile et précise de l'acquisition de données in vivo d'événements cellulaires et sub-cellulaires par rapport aux animaux anesthésiés (figure 1J et 3C-F ^4).

Dimensions de l'appareil ont été modifiées pour permettre imagerie time-lapse de différents stades de C. elegans, Drosophila larves de premier stade et les larves de poisson zèbre. Transport de vésicules marquées par synaptotagmine marqués à la GFP (syt.eGFP) dans les neurones sensoriels montre mouvement dirigé des marqueurs de vésicules synaptiques cholinergiques exprimés dans les neurones sensoriels de larves de premier stade intacte chez la drosophile. Un dispositif similaire a été utilisée pour effectuer imagerie time-lapse de battement de coeur dans ~ 30 heures après la fécondation (HPF)poisson-zèbre larves. Ces données montrent que les dispositifs simples que nous avons développées peuvent être appliquées à une variété de systèmes modèles pour étudier les phénomènes cellulaires plusieurs biologiques et de développement in vivo.