В Ovo Электропорация в эмбриональной сетчатки Chick

Summary

Основная цель этого видео, чтобы показать, как выполнять целевые сетчатки впрыска и<em> В ово</em> Электропорации ДНК / РНК конструкций в куриных эмбриональных сетчатки на гамбургер и Гамильтон стадии 22-23, что составляет около 4-й день эмбрионального (Е4). Эта техника очень полезна для изучения экспрессии генов, регуляции генов и морфологические изменения в развивающихся куриных сетчатки.

Abstract

Куриные эмбриональных сетчатки является отличным инструментом для изучения развития сетчатки у высших позвоночных. Из-за больших размеров и внешнего развития, это сравнительно легко манипулировать куриных эмбриональных сетчатки с использованием рекомбинантной ДНК / РНК технологии. Электропорации ДНК / РНК конструкций в эмбриональной сетчатки имеют большое преимущество для изучения регуляции генов в сетчатку стволовых / прогениторных клеток в процессе развития сетчатки. Различные типы тестов, такие как ген-репортер анализ, ген за выражение, ген сбить (ShRNA) и т.д. можно выполнить с помощью электропорации техники. Это видео демонстрирует целевой сетчатки инъекции и ово электропорации в эмбриональной сетчатки куриного на гамбургер и Гамильтон стадии 22-23, что составляет около 4-й день эмбрионального (Е4). Здесь мы показываем, быстрый и удобный в ово техника электропорации которой ДНК плазмиды, что выражает зеленый флуоресцентный белок (GFP) в качестве маркера доставляется вкуриных эмбриональных субретинальной пространство и затем электрические импульсы, чтобы облегчить поглощение ДНК сетчатки стволовых / прогениторных клеток. Новый метод сетчатки инъекции и электропорации на E4 обеспечивает визуализацию всех типов клеток сетчатки, в том числе позднего происхождения нейроны ^1, который было трудно с обычным методом инъекции и электропорации на E1.5 ^2.

Protocol

Так как некоторые части протокола осуществляется, как описано ранее в других Юпитер видео 2 и статьи 3, с незначительными изменениями мы не будем обсуждать те подробно. 1. Обработка яиц и иглы подготовка Яйца можно хранить в винный холодильник примерно н?…

Discussion

Целевые сетчатки инъекции и электропорации ово в эмбриональные сетчатки на стадии E4 может конкретно сетчатки клеток-предшественников в результате чего способность визуализировать все шесть основных типов клеток сетчатки на одном уровне клетки. В ово электропорации в H…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
Fertilized pathogen-free (SPF) white leghorn chicken eggs	Sunrise Farms (Catskill, NY)
Chicken egg incubator	GQF manufacturing, Savannah, GA	Model-1550	Set to 60% humidity and 37.5°C.
Glass capillary tubes	World Precision Instrument Inc.	TW150F-4
0.1 ml syringe	Hamilton Co. Reno, Nevada	Gastight 1710	Alternatively 1ml syringe can be used as well
Masterflex Silicone (peroxide) Tubing	Cole-Parmer	HV-96400-13	Cut a small piece (1 cm) for attaching the glass needle to the syringe
Tweezers	Dumont	AA
Micromanipulator	World Precision Instrument Inc.	M3301-M3
Plasmid DNA			pCAG-GFP was borrowed from Dr. Connie Cepko
Fast Green FCF	Sigma-Aldrich	F7252	Dilute it to 0.025 % with PBS
Pulse generator	Harvard Apparatus, MA	BTX ECM 830	Square wave generator
Electrodes	Harvard Apparatus, MA	BTX model 514	Our electrodes were spaced 3-5 mm apart
Monochrome Digital Camera	Zeiss, Germany	Axiocam MRM
Fluorescent Dissection Microscope	Leica Microsystems, Germany	Leica MZ16FA
Upright Fluorescence Microscope	Zeiss, Germany	Zeiss Axio Imager A1