Основная цель этого видео, чтобы показать, как выполнять целевые сетчатки впрыска и<em> В ово</em> Электропорации ДНК / РНК конструкций в куриных эмбриональных сетчатки на гамбургер и Гамильтон стадии 22-23, что составляет около 4-й день эмбрионального (Е4). Эта техника очень полезна для изучения экспрессии генов, регуляции генов и морфологические изменения в развивающихся куриных сетчатки.
Abstract
Куриные эмбриональных сетчатки является отличным инструментом для изучения развития сетчатки у высших позвоночных. Из-за больших размеров и внешнего развития, это сравнительно легко манипулировать куриных эмбриональных сетчатки с использованием рекомбинантной ДНК / РНК технологии. Электропорации ДНК / РНК конструкций в эмбриональной сетчатки имеют большое преимущество для изучения регуляции генов в сетчатку стволовых / прогениторных клеток в процессе развития сетчатки. Различные типы тестов, такие как ген-репортер анализ, ген за выражение, ген сбить (ShRNA) и т.д. можно выполнить с помощью электропорации техники. Это видео демонстрирует целевой сетчатки инъекции и ово электропорации в эмбриональной сетчатки куриного на гамбургер и Гамильтон стадии 22-23, что составляет около 4-й день эмбрионального (Е4). Здесь мы показываем, быстрый и удобный в ово техника электропорации которой ДНК плазмиды, что выражает зеленый флуоресцентный белок (GFP) в качестве маркера доставляется вкуриных эмбриональных субретинальной пространство и затем электрические импульсы, чтобы облегчить поглощение ДНК сетчатки стволовых / прогениторных клеток. Новый метод сетчатки инъекции и электропорации на E4 обеспечивает визуализацию всех типов клеток сетчатки, в том числе позднего происхождения нейроны 1, который было трудно с обычным методом инъекции и электропорации на E1.5 2.
Protocol
Так как некоторые части протокола осуществляется, как описано ранее в других Юпитер видео 2 и статьи 3, с незначительными изменениями мы не будем обсуждать те подробно. 1. Обработка яиц и иглы подготовка Яйца можно хранить в винный холодильник примерно н?…
Discussion
Целевые сетчатки инъекции и электропорации ово в эмбриональные сетчатки на стадии E4 может конкретно сетчатки клеток-предшественников в результате чего способность визуализировать все шесть основных типов клеток сетчатки на одном уровне клетки. В ово электропорации в H…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить г-на Маац Энвер для использования его камера HD (Cannon VIXIA HFS100). Эта работа была частично поддержана грантами NIH (EY018738), Нью-Джерси комиссии по исследованию спинного мозга (08-3074-SCR-E-0 и 10-3091-SCR-E-0), а Буш биомедицинских исследований Award.
Materials
Name of the reagent
Company
Catalogue number
Comments
Fertilized pathogen-free (SPF) white leghorn chicken eggs
Sunrise Farms (Catskill, NY)
Chicken egg incubator
GQF manufacturing, Savannah, GA
Model-1550
Set to 60% humidity and 37.5°C.
Glass capillary tubes
World Precision Instrument Inc.
TW150F-4
0.1 ml syringe
Hamilton Co. Reno, Nevada
Gastight 1710
Alternatively 1ml syringe can be used as well
Masterflex Silicone (peroxide) Tubing
Cole-Parmer
HV-96400-13
Cut a small piece (1 cm) for attaching the glass needle to the syringe