Vi beskriver bruk av en stoppet-flow instrument for å undersøke både reduktive og oksidativt halv-reaksjoner fra<em> Aspergillus fumigatus</em> Siderophore A (Sida), en Flavin-avhengig monooxygenase. Så viser spektrene tilsvarende artene på den reaksjonen av Sida og vi beregne hastighetskonstanter for dannelse deres.
Aspergillus fumigatus siderophore A (Sida) er en FAD-holdig monooxygenase som katalyserer hydroksylering av ornithine i biosyntesen av hydroxamate siderophores som er viktig for virulens (f.eks ferricrocin eller N ', N ", N'''-triacetylfusarinine C) 1. Reaksjonen katalyseres av Sida kan deles inn i reduktive og oksidativt halv-reaksjoner (Scheme 1). I reduktive halvreaksjon, blir oksidert FAD bundet til en f Sida, redusert med NADPH 2,3. I oksidativt halvreaksjon , redusert kofaktor reagerer med molekylært oksygen for å danne en C4a-hydroperoxyflavin middels, som overfører en oksygen atom til ornithine. Her beskriver vi en prosedyre for å måle prisene og oppdage de ulike spektrale former for Sida bruke en stoppet-flow instrument installert i en anaerob hanskerommet. I stoppet-flow instrument, små mengder reaktanter er raskt blandet, og etter at strømmen er stoppet av the stopp sprøyte (figur 1), blir spektrale endringer av løsningen plassert i observasjonen cellen registrert over tid. I første del av eksperimentet, viser vi hvordan vi kan bruke stoppet-flow instrument i én modus, hvor den anaerobe reduksjon av Flavin i A f Sida av NADPH blir direkte målt. Vi bruker doble blande miljøer hvor A f Sida er første anaerobt reduseres med NADPH for en utpekt periode i en aldrende løkke, og deretter reagerte med molekylær oksygen i observasjonen celle (figur 1). For å utføre dette eksperimentet, anaerobe buffere er nødvendig fordi når bare den reduktive halvreaksjon overvåkes, vil enhver oksygen i løsningene reagere med redusert Flavin kofaktor og danne en C4a-hydroperoxyflavin mellomliggende som til slutt vil råtne tilbake i oksidert Flavin . Dette ville ikke tillate brukeren å måle utbredelsen av reduksjon siden det ville være fullstendig omsetning av EnzYme. Når den oksidative halvreaksjon blir studert enzymet må reduseres i fravær av oksygen, slik at bare de trinnene mellom reduksjon og oksidasjon er observert. En av buffere som brukes i dette forsøket er oksygen mettet slik at vi kan studere oksidativt halvreaksjon ved høyere konsentrasjoner av oksygen. Disse er ofte de prosedyrer som utføres når en skal studere enten reduktive eller oksidativt halv-reaksjoner med Flavin-holdige monooxygenases. Tiden omfanget av de pre-steady-state eksperimenter utført med stoppet-flow er millisekunder til sekunder, som tillater bestemmelse av iboende hastighetskonstanter og påvisning og identifikasjon av mellomprodukter i reaksjonen 4. Prosedyrene som er beskrevet her kan brukes til andre Flavin-avhengige monooxygenases. 5,6
Enzymer som katalyserer redoksreaksjoner vanligvis inneholder kofaktorer som hemes og flavins som gjennomgår betydelige absorbansavlesninger endringer i løpet av katalytiske syklusen. Den oksidert form av Flavin presenterer absorbans maxima på ~ 360 og 450 nm, og reduksjonen er typisk overvåkes ved å følge absorbansen nedgang på 450 nm 7. Generelt noen forbigående mellomprodukter er til stede, men formen og forfall for fort til å bli målt i faste spektrofotometre. Bruke Applied Photophysics SX20 stoppet-flow spektrofotometer (eller lignende instrumenter), er det mulig å måle absorbans endringer i millisekund tidsskalaen (dead-tiden, 2 ms). Her har vi studert de reduktive og oksidativt halv-reaksjoner i Flavin-avhengige monooxygenase A f Sida, som tjener som en modell. Satsen for hydride overføringen ble bestemt ved å måle endring av absorbansen ved 452 nm etter blanding enzymet med NADPH under anaerobe forhold. Senere, tar advantage av den doble blanding modus på stoppet-flow instrument, ble det enzymet første reagerte med NADPH, inntil full reduksjon ble oppnådd, da den reduserte enzymet-NADP + komplekset ble blandet med oksygen. Etter denne prosedyren, er det mulig å oppdage forbigående oksygenerte Flavin mellomprodukter og å måle utbredelsen av dannelse og forfall. Identifiseringen av disse mellomprodukter gir eksperimentelle data om arten av de som reagerer arter i katalyse. I tilfelle av en f Sida, dannelsen av C4a-hydroperoxyflavin (typisk overvåkes ved 370-380 nm), som er den hydroxylating arter. I tillegg måle hastighetskonstanten av hvert trinn gjør det mulig å få informasjon om det hastighetsbegrensende bestemme trinnet i reaksjonen og bidra til å belyse de kinetiske og kjemiske mekanismer av enzymet.
Generelt kan lignende tilnærminger brukes til andre flavoenzymes, eller proteiner som absorbans skjedd endringer, for eksempel proteiner som fortsain heme, pyridoxal-fosfat, eller ikke-heme jern 8-10. En begrensning med denne metoden er at store mengder renset enzymet er nødvendig, men dette kan løses ved hjelp av et uttrykk system med høy avkastning. En bestemmer optimal protein konsentrasjon for opptak spektra ved hjelp av nok protein, slik at et sterkt nok signal kan observeres, men ikke for mye slik at enzymet ikke er bortkastet. Vanligvis er den laveste enzymet konsentrasjon for Flavin-holdige enzymer som brukes i stoppes-flømmingseksperimenter 6-10 mM (etter blanding) og fastsettes med tilsvarende molare utryddelse koeffisient av enzymet. I tilfelle av en f Sida, er prosentandelen av enzymet bundet FAD 50-65% 2. Apo-protein regnes som inaktive i disse forsøkene, fordi en innbundet FAD kofaktor er nødvendig for katalyse. En annen mulig begrensning med denne metoden er hvis prosessene i et enzym skje raskere enn 2 ms (død tidspunktet for stanset-flow) de ikke vil bli observert, men there rapporteres strategier hvor prisene kan reduseres for å overvinne dette problemet. Et eksempel på dette inkluderer bruk en høy NaCl konsentrasjon i reaksjon på en ferredoxin-NADP + reduktase 11. Den skrubbing av oksygen fra flyten krets av stanset-flow er ofte en vanskelig skritt i dette eksperimentet, og krever spesiell oppmerksomhet. Den glukose oksidase-glukose system som beskrives her er brukt med hell i de fleste laboratorier som det er en effektiv og rimelig metode. Det er imidlertid noen ulemper som omfatter produksjon av H 2 O 2 og for enkelte programmer andre alternativer som protocatechuate dioxygenase-protocatechuate system bør vurderes 12. Utnyttelse av en anaerob hanskerommet gjør det lettere å sikre anaerobe forhold, men er ikke avgjørende. Oksygen må fjernes fra flyten krets av stanset-flow som vi ønsker at enzymet reduseres i fravær av oksygen eller reagere med oksygen på konsentrasjons som vi angir. Selv om stanset-flow er i hanskerommet, det er oksygen i flyten kretsen hvis vi hadde brukt aerobic buffere i tidligere forsøk. I tillegg til absorpsjonsmålingene, kan fluorescens og rundskriv dichroism analysene utføres i Applied Photophysics SX20 stoppet-flow spektrofotometer med tilsvarende tilbehør.
The authors have nothing to disclose.
Forskning støttet av NSF award MCB-1021384.
General Laboratory Equipment | Company | Catalogue Number |
Vacuum pump | Welch | – |
Büchner flasks | Fisher | 70340-500 |
Stir bars | Fisher | 14-512-129 |
Stir plates | Fisher | 11-100-49S |
Schlenk lines | Kontes Glass | – |
Argon tank | Airgas | AR UPC300 |
Nitrogen tank | Airgas | NI200 |
Nitrogen tank, ultra high purity grade | Airgas | NI UHP200 |
Oxygen tank | Airgas | OX 40 |
5% Hydrogen balance nitrogen tank | Airgas | X02NI95B200H998 |
SX20 Stopped-flow spectrophotometer | AppliedPhotophysics | – |
Glove box | Coy | – |
Water bath | Brinkmann Lauda | – |
Supplies | ||
50 mL BD Falcon tubes | Fisher | 14-432-23 |
15 mL BD Falcon conical tubes | Fisher | 05-527-90 |
1.5 mL Eppendorf microcentrifuge tubes | Fisher | 05-402-18 |
50 and 25 mL glass vials | Fisher | 06-402 |
Rubber stoppers | Fisher | 06-447H |
Aluminum seals | Fisher | 06-406-15 |
Reagents | ||
Potassium phosphate, monobasic | Fisher | AC2714080025 |
Potassium phosphate, dibasic | Fisher | P288-500 |
Sodium acetate | Sigma | S-2889 |
Glucose oxidase from A. niger | Sigma | G7141-250KU |
D-Glucose | Fisher | D16-500 |
β-NADPH | Fisher | ICN10116783 |
L(+)-Ornithine hydrochloride | Fisher | ICN10116783 |