Realtidsövervakning av ligand-receptor interaktion med fluorescensresonansenergiöverföring
Summary
Vi visar FRET mellan konjugerad polymer polydiacetylen (PDA) och fluorofor fäst till ytan av PDA liposomer för avkänning av biomolekyler. PDA liposomer innehöll också receptormolekyler på sina ytor för biomolekyler som kan användas som prober. Ligand-receptor interaktioner leder till förändringar i FRET effektivitet mellan fluoroforen och PDA som utgör grunden för den avkännande mekanismen.
Abstract
FRET är en process där energi är icke-radiativt överförs från en exciterad donatormolekyl till jord-state acceptormolekyl genom långväga dipol-dipol-interaktioner 1. I föreliggande avkänning analysen använder vi en intressant egenskap hos PDA: blå-förskjutning i UV-Vis elektronisk absorptionsspektrum av PDA (figur 1) efter en analyt interagerar med receptorer kopplade till PDA 2,3,4,7. Denna förskjutning av PDA absorptionsspektrum ger förändringar i spektral överlappning (J) mellan PDA (acceptor) och rodamin (donator) som leder till förändringar i FRET effektivitet. Sålunda är interaktionen mellan analyt (ligand) och receptorer detekteras genom FRET mellan donator fluoroforer och PDA. I synnerhet, visar vi avkänningen av en modell proteinmolekyl streptavidin. Vi visar också kovalent-bindning av bovint serumalbumin (BSA) till liposomytan med FRET mekanism. Dessa interaktioner mellan tHan tvåskiktsmembran liposomer och proteinmolekyler kan kännas i realtid. Den föreslagna metoden är en generell metod för att avkänna små kemiska och stora biokemiska molekyler. Eftersom fluorescens är inneboende mer känslig än kolorimetri, kan detektionsgränsen för analysen vara i sub-nanomolära området eller lägre 8. Vidare, kan PDA fungera som en universell acceptor i FRET, vilket innebär att flera sensorer kan utvecklas med PDA (acceptor) funktionaliserade med givare och olika receptorer fästa på ytan av PDA liposomer.
Protocol
Discussion
Vi har utfört selektiv bindning av lysinrest av protein på liposomytan med NHS-amin reaktion. Detta FRET metod är kapabel att göra Realtidsövervakning av biotin-streptavidin-bindning och protein (BSA) bindning till liposomytan. Liknande förfarande kan användas för att studera de bindande dynamiken i olika proteininteraktioner med sina selektiva receptorer. Det finns flexibilitet i valet fluoroforer som ger förändringar i J-värden beroende på de spektrala egenskaperna hos fluoroforerna. PDA är en un…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ekonomiskt stöd till detta arbete ges genom National Science Foundation, National Institute of Health (NIH), Materials Technology Center (MTC) och ORDA på SIUC. Vi tackar NSF om bidrag (CHE-0.959.568) för inköp av en FE-SEM. Vi vill tacka professor Matthew McCarroll för hjälp diskussioner. Julia Reyes kommer tacka Colciencias, colombianska Agency och Universidad Pedagogica y Tecnologica de Colombia för hennes stipendium och finansiellt stöd.
Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| 10,12-pentacosadiynoic acid (PCDA) | GFS chemicals | 3261 | Light sensitive |
| N-hydroxysuccinimide (NHS) | Acros organics | 157270250 | Moisture sensitive |
| 1-(3-(dimethylamino)propyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC) | Chem-impex International | 00050 | |
| 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC) | Avanti Polar lipids | 850345P | |
| Rhodamine-tagged Bovine Serum Albumin (BSA-Rh) | Sigma Aldrich | A4537 | |
| (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(biotinyl)(biotin-DOPE) | Avanti Polar lipids | 870282 |
References
- Lakowicz, J. R. . Principles of Fluorescence Spectroscopy. , (1999).
- Charych, D. H., Nagy, J. O., Spevak, W., Bednarski, M. D. Direct Colorimetric Detection of a Receptor-Ligand Interaction by a Polymerized Bilayer Assembly. Science. 261, 585-588 (1993).
- Yoon, B., Lee, S., Kim, J. -. M. Recent Conceptual and Technological Advances in Polydiacetylene-based Supramolecular Chemosensors. Chem. Soc. Rev. 38, 1958-1968 (2009).
- Xuelian, L. i., Kohli, P. u. n. i. t. Investigating Molecular Interactions in Biosensors Based on Fluorescence Resonance Energy Transfer. J. Phys. Chem. C. 114, 6255-6264 (2010).
- Li, X., Matthews, S., Kohli, P. Fluorescence Resonance Energy Transfer in Polydiacetylene Liposomes. J. Phys. Chem. B. 112, 13263-13272 (2008).
- Li, X., McCarroll, M., Kohli, P. Modulating Fluorescence Resonance Energy Transfer in Conjugated Liposomes. Langmuir. 22, (2006).
- New, R. R. C., New, R. R. C. . Liposomes: A Practical Approach. , 33-104 (1990).
- Chen, X., Lee, J., Jou, M. J., Kim, J. -. M., Yoon, J. Colorimetric and Fluorometric Detection of Cationic Surfactants Based on Conjugated Polydiacetylene Supramolecules. Chem. Commun. , 3434-3436 (2009).
- Yarimaga, O., Im, M., Choi, Y. -. K., Kim, T. W., Jung, Y. K., Park, H. G., Lee, S., Kim, J. -. M. A Color Display System Based on Thermochromic Conjugated Polydiacetylene. Macromolecular Research. 18, 404-407 (2010).
