En genetisk skärm för att isolera Toxoplasma gondii Host-cell avstigning mutanter

Summary

Forward genetik är en kraftfull metod att riva upp molekylär nivå hur<em> Toxoplasma</em> Utträder från sin värdcell. Protokoll finns att kemiskt mutera parasiter, anrika mutanter med defekter i inducerad utträde, och validera fenotypen av klonade mutanter.

Abstract

Den utbredda, obligat intracellulär, protozoparasit Toxoplasma gondii orsakar opportunistisk sjukdom hos immunkomprometterade patienter och orsakar fosterskador vid kongenital infektion. Den lytiska replikationscykeln kännetecknas av tre steg: 1. aktivt invasion av en kärnförsedda värdcell, 2. replikation inuti värdcellen, 3. aktiv utstigning ur värdcellen. Mekanismen för avstigning i allt högre grad uppskattad som en unik, starkt reglerad process, som fortfarande är dåligt förstådd på molekylär nivå. De signalvägar bakom utträde har präglats genom användning av farmakologiska substanser som påverkar olika aspekter av de vägar ^1-5. Som sådan har flera oberoende utlöser utträde identifierats vilka alla konvergerar på frisättningen av intracellulära Ca ^{2 +,} en signal som är också kritisk för värdcellen invasion ^6-8. Denna insikt informerat en strategi kandidat gen som ledde till identiklassificering av växter som kalcium beroende proteinkinas (CDPK) som deltar i avstigning ^9. Dessutom har flera nya genombrott i förståelsen utträde gjorts med (kemisk) genetiska metoder ^10-12. Att kombinera den rikedom av farmakologiska information med den ökande genetiska tillgängligheten av Toxoplasma vi nyligen inrättat en skärm som tillåter anrikning för parasitens mutanter med en defekt i värdcell utträde ^13. Även kemisk mutagenes med användning av N-etyl-N-nitrosokarbamid (ENU) eller etylmetansulfonat (EMS) har använts under årtionden för studier av Toxoplasma biologi ^11,14,15, först nyligen har genetisk kartläggning av mutationer som ligger bakom de fenotyper blivit rutin ^{16 -18.} Vidare, genom att generera temperaturkänsliga mutanter, kan väsentliga processer dissekerades och de underliggande gener direkt identifieras. Dessa mutanter uppträder som vild-typ enligt den tillåtna temperaturen (35 ° C), men misslyckas med att proliferate vid den restriktiva temperaturen (40 ° C) som en följd av mutationen i fråga. Här illustrerar vi en ny fenotypisk screening metod för att isolera mutanter med en temperaturkänslig utträde fenotyp ^13. Utmaningen för utträde skärmar är att separera egressed från icke-egressed parasiter, vilket kompliceras av snabb åter-invasion och allmänt klibbighet av parasiterna till värdcellerna. En tidigare etablerade avstigning skärmen bygger på en besvärlig serie biotinyleringsbeting åtgärder för att separera intracellulär från extracellulära parasiter ^11. Denna metod inte heller genererar villkorliga mutanter resulterar i svaga fenotyper. Den metod som beskrivs här övervinner starka engagemang för utträder parasiter genom att inkludera en glykan konkurrent dextransulfat (DS), som förhindrar parasiter fastnar värdcellen ^19. Dessutom är extracellulära parasiter specifikt avdödades genom pyrrolidin-ditiokarbamat (PDTC), vilket lämnar intracellulära parasiteroskadda ^20. Därför, med en ny fenotypisk skärm för att specifikt isolera parasiter mutanter med defekter i inducerad utträde, kan kraften i genetik nu fullt ut för att reda ut de molekylära mekanismerna bakom utträde värdcell.

Protocol

Översikt Protokoll är anordnade för att först definiera den dosering av den mutagena leder till en 70% avdödning av parasiterna (protokoll 1). Nästa förfarande för att berika inducerade avstigning mutanter från en muterad parasit pool (protokoll 2, figur 2). Detta följs av ett protokoll för att testa förekomsten av avstigning mutanter i den anrikade poolen, eller för att validera utgångsprocessen fenotypen i individuella mutanter (protokoll 3). Slutligen, är ett protokoll för at…

Discussion

Den beskrivna protokollet tillhandahåller en effektiv metod för att isolera Toxoplasma mutanter med en utgång defekt. Vi har med framgång isolerat mutanter längs olika stegen av egress-vägen, av vilka några har en dubbel invasion fenotyp ^13. Potentiella effekter på invasion kan bestämmas med hjälp av så kallade röd-gröna analys, som skiljer invaderade från icke-invaderat parasiter av differentiell antikroppsfärgning ^23,24. För båda invasion och avstigning analyser ka…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
ENU	Sigma-Aldrich	N3385	1 M Stock in DMSO, store at -20°C
EMS	Sigma-Aldrich	M0880	1 M Stock in DMSO, store at -20°C
Dextran Sulfate	Sigma-Aldrich	D4911
PDTC	Sigma-Aldrich	P8765	100 mM Stock in PBS
Diff Quick	EMD Chemicals	65044-93
Filter holder	Cole-Parmer	540100
3 μm polycarbonate filter	Whatman Schleicher & Schuell	110612
Hemocytometer	Hausser Scientific	1475
CO2 incubators	Various manufacturers		Humidified, 5% CO2, at 35, 37 and 40°C
Fluorescence microscope	Various manufacturers		Ideally inverted, wide-field with 63x or 100x oil objective

HBSSc (according to Black et al.¹¹):

• 98.0 ml Hanks Balanced Salt Solution (Hyclone catalog number SH30588)
• 100 μl 1M MgCl₂ (100 mM end)
• 100 μl 1M CaCl₂ (100 mM end)
• 2.0 ml 1M Hepes pH 7.3 (20 mM end)
• 84 mg NaHCO₃ (10 mM end)