En Screeningsteknikken å isolere Toxoplasma gondii Host-celle Egress Mutants

Summary

Forward genetikk er en kraftig metode for å avdekke molekylære nivå av hvordan<em> Toxoplasma</em> Egresses fra sin vertscellen. Protokollene er gitt til kjemisk mutagenize parasitter, berike for mutanter med defekter i indusert egress, og validere fenotype av klonede mutanter.

Abstract

Den utbredte, obligate intracellulære, protozo parasitten Toxoplasma gondii forårsaker opportunistisk sykdom i immuno-kompromitterte pasienter og forårsaker fødselsdefekter ved medfødt infeksjon. Den lytisk replikasjon syklusen er preget av tre stadier: 1. aktiv invasjon av en kjerneholdige vertscelle; to. replikering inne i vertscellen, 3. aktiv egress fra vertscellen. Mekanismen for egress blir i økende grad verdsatt som en unik, svært regulert prosess, som fortsatt er dårlig forstått på molekylært nivå. De signalveier underliggende egress har vært preget gjennom bruk av farmakologiske preparater som virker på ulike aspekter av banene ^1-5. Som sådan har flere uavhengige utløsere av egress blitt identifisert som alle konvergerer på utgivelsen av intracellulær Ca ^{2 +,} et signal som også er kritisk for vertscelle invasjon ^6-8. Denne innsikten informert en kandidat gen tilnærming som førte til identifiseringen av anlegget som kalsium avhengig protein kinase (CDPK) involvert i egress ^9. I tillegg har flere nylige gjennombrudd i forståelsen egress blitt gjort ved hjelp av (kjemisk) genetiske tilnærminger ^10-12. Å kombinere vell av farmakologiske informasjon med økende genetisk tilgjengeligheten av Toxoplasma vi nylig etablert en skjerm tillater berikelse for parasitten mutanter med en defekt i vertscelle egress ^13. Selv om kjemisk mutagenese bruke N-etyl-N-nitrosourea (ENU) eller etyl methanesulfonate (EMS) har vært brukt i flere tiår i studiet av Toxoplasma biologi ^11,14,15, bare nylig har genetisk kartlegging av mutasjoner som ligger bak fenotyper bli rutine ^{16 -18.} Videre, ved å generere temperaturfølsomme mutanter, kan viktige prosesser bli dissekert og de underliggende genene direkte identifisert. Disse mutantene oppfører seg som vill-type under ettergivende temperatur (35 ° C), men mislykkes i å proliferate ved den restriktive temperatur (40 ° C) som følge av mutasjon i spørsmålet. Her har vi illustrere en ny fenotypisk screening metode for å isolere mutanter med en temperatur-sensitiv egress fenotype ^13. Utfordringen for utgående skjermer er å skille egressed fra ikke-egressed parasitter, som kompliseres av rask re-invasjon og generell Stickiness av parasittene til vertsceller. En tidligere etablert egress skjerm var basert på en tungvint serie biotinylation skritt for å skille intracellulær fra ekstracellulære parasitter ^11. Denne metoden heller ikke generere betingede mutanter resulterer i svake fenotyper. Metoden beskrevet her overvinner den sterke tilknytning til egressing parasitter ved å inkludere en glykan konkurrent, dekstransulfat (DS), som hindrer parasitter fra stikker til vertscellen ^19. Videre er ekstracellulære parasitter spesifikt drept av ved pyrrolidine dithiocarbamate (PDTC), som etterlater intracellulære parasitteruskadd ^20. Derfor, med en ny fenotypisk skjermen for å spesifikt isolere parasitten mutanter med defekter i indusert egress, kan kraften av genetikk nå bli fullt utviklet for å avdekke molekylære mekanismene bak vertscellen egress.

Protocol

Oversikt Protokoller er forutsatt å først definere dosering av mutagen fører til en 70% drap av parasitter (protokoll 1). Den neste prosedyre for å berike de induserte utgående mutantene fra en mutagenized parasitt basseng (protokoll 2, figur 2). Dette etterfølges av en protokoll for å teste forekomst av utgående mutanter i anriket bassenget, eller å validere egress fenotypen i enkelte mutanter (protokoll 3). Endelig er en protokoll gis for å generere enkle parasitten kloner fra berik…

Discussion

Den beskrives protokollen gir en effektiv metode for å isolere Toxoplasma mutanter med en egress defekt. Vi har lyktes i å isolere mutanter langs ulike stegene i egress vei, hvorav noen har en dobbel invasjon fenotype ^13. Potensielle effekter på invasjon kan bestemmes ved hjelp av såkalt rød-grønn-analysen, som skiller invaderte fra ikke-invaderte parasitter ved differensial antistoff farging ^23,24. For både invasjonen og egress analysene kan det være praktisk å uttrykke en …

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
ENU	Sigma-Aldrich	N3385	1 M Stock in DMSO, store at -20°C
EMS	Sigma-Aldrich	M0880	1 M Stock in DMSO, store at -20°C
Dextran Sulfate	Sigma-Aldrich	D4911
PDTC	Sigma-Aldrich	P8765	100 mM Stock in PBS
Diff Quick	EMD Chemicals	65044-93
Filter holder	Cole-Parmer	540100
3 μm polycarbonate filter	Whatman Schleicher & Schuell	110612
Hemocytometer	Hausser Scientific	1475
CO2 incubators	Various manufacturers		Humidified, 5% CO2, at 35, 37 and 40°C
Fluorescence microscope	Various manufacturers		Ideally inverted, wide-field with 63x or 100x oil objective

HBSSc (according to Black et al.¹¹):

• 98.0 ml Hanks Balanced Salt Solution (Hyclone catalog number SH30588)
• 100 μl 1M MgCl₂ (100 mM end)
• 100 μl 1M CaCl₂ (100 mM end)
• 2.0 ml 1M Hepes pH 7.3 (20 mM end)
• 84 mg NaHCO₃ (10 mM end)