Primær microglia Isolasjon fra Blandede glial cellekulturer fra Neonatal Rat hjernevev
Summary
Isolere primære microglia fra mobilnettet heterogenitet av hjernen er viktig å undersøke deres rolle i både fysiologiske og patologiske forhold. Denne protokollen beskriver en mekanisk isolering og blandet cellekultur teknikk som gir høy avkastning og høy renhet, levedyktige primære microglial celler for<em> In vitro</em> Studie-og nedstrøms applikasjoner.
Abstract
Microglia utgjør ca 12% av den totale mobilnettet befolkningen i hjernen hos pattedyr. Mens nevroner og astrocytes anses de viktigste celletypene i nervesystemet, microglia spille en betydelig rolle i normal hjerne fysiologi ved å overvåke vev for rusk og patogener og opprettholde homeostase i parenchyma via phagocytic aktivitet 1,2. Microglia aktiveres under en rekke skader og sykdom forhold, herunder nevrodegenerativ sykdom, traumatisk hjerneskade, og nervesystemet infeksjon tre. Under disse aktiverende forholdene, microglia øke phagocytic aktivitet, gjennomgår morpohological og proliferativ forandring, og aktivt skiller reaktive oksygen og nitrogen arter, pro-inflammatoriske chemokines og cytokiner, ofte aktivere en parakrine eller autocrine sløyfe 4-6. Ettersom disse microglial svar bidra til sykdom patogenesen i nevrologiske tilstander, fokusert forskning på microglia er berettiget.
På grunn av den cellulære heterogenitet i hjernen, er det teknisk vanskelig å oppnå tilstrekkelig microglial prøvemateriale med høy renhet under in vivo eksperimenter. Aktuell forskning på de nervecellene og nevrotoksiske funksjoner microglia krever en rutine teknisk metode for å konsekvent generere ren og sunn microglia med tilstrekkelig kapasitet for studien. Vi presenterer i tekst og video, en protokoll for å isolere ren primære microglia fra blandede gliaceller kulturer for en rekke nedstrøms applikasjoner. Kort, benytter denne teknikken skilt hjernevev fra nyfødte rotteunger til å produsere blandede glial cellekulturer. Etter blandede glial kulturer nå confluency, er primære microglia mekanisk isolert fra kulturen ved en kort varighet av risting. De microglia blir deretter belagt med høy renhetsgrad for eksperimentell studie.
Prinsippet og protokoll av denne metodikken har værtbeskrevet i litteraturen 7,8. I tillegg er alternative metoder for å isolere primære microglia godt beskrevet 9-12. Homogenisert hjernevev kan separeres ved tettshetsgradient sentrifugering å gi primær microglia 12. Imidlertid er det sentrifugering av moderat lengde (45 min) og kan forårsake cellulær skade og aktivisering, samt, føre beriket microglia og andre cellulære populasjoner. En annen protokoll er blitt brukt til å isolere primær microglia i en rekke organismer ved lengre (16 t) ristet mens i kultur 9-11. Etter risting er media supernatanten sentrifugere å isolere microglia. Dette lenger to-trinns isolasjon metoden kan også måner microglial funksjon og aktivisering. Vi hovedsakelig benytte følgende microglia isolasjon protokoll i vårt laboratorium for en rekke årsaker: (1) primær microglia simulere in vivo biologi mer trofast enn udødeliggjorde gnager microglia cellelinjer, (2) Nominell mekanisk forstyrrelse reduserer potensialet cellulær dysfunksjon eller aktivering, og (3) tilstrekkelig avkastning kan oppnås uten passasje av de blandede glial cellekulturer.
Det er viktig å merke seg at denne protokollen bruker hjernevev fra nyfødte rotteunger å isolere microglia og at bruk av eldre rotter å isolere microglia kan ha betydelig innvirkning på avkastningen, aktivering status, og funksjonelle egenskaper av isolerte microglia. Det er dokumentert at aldring er koblet med microglia dysfunksjon, økt neuroinflammation og nevrodegenerative sykdommer, har så tidligere studier brukte ex vivo voksen microglia å bedre forstå den rollen microglia i nevrodegenerative sykdommer hvor aldring er viktig parameter. Imidlertid kan ex vivo microglia ikke holdes i kultur i lengre perioder av gangen. Derfor, mens denne protokollen forlenger livet til primære microglia i kultur, bør det bemerkes at microglia oppfører differently fra voksen microglia og in vitro studier bør vurderes nøye når oversatt til en in vivo setting.
Protocol
Discussion
Mens denne protokollen er rutinemessig utnyttes til å produsere ren og sunn microglia for forskning eksperimenter, vil en nøye vurdering av tekniske forhold i løpet av kritiske deler av prosedyren minimere variasjonen i den isolerte microglia. Først under disseksjon av hjernevev fra nyfødte rotteunger, arbeider i tide er nødvendig for å minske hypoksisk og iskemisk skade på vev. Men det er også viktig å fullstendig fjerne meningeal dekker fra hjernen under disseksjon, fordi tilstedeværelsen av hjernehinnene v…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Finansiert av egenutført programmet ved Uniformert Services University.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments |
| 60 mm x 15 mm Petri dishes | Fisher brand | 0875713A | |
| Sharp dissecting scissors | Fine Science Tools | 14094-11 | |
| Dumont #7b forceps- standard tips, curved, 11cm | Fine Science Tools | 11270-20 | |
| Dumont #5 forceps-standard tips, straight, 11 cm | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| 50 ml conical centrifuge tubes | VWR | 89039-656 | |
| 5 ml serological pipettes | Grenier Bio One | 606180 | |
| 10 ml serological pipettes | Grenier Bio One | 607180 | |
| 100 μm sterile nylon cell strainer | Falcon | 35-2360 | |
| 75 cm2 tissue culture flasks | Corning | 430641 | |
| Dulbecco’s minimal essential medium (DMEM) | Gibco (Invitrogen) | 31053-028 | |
| Leibovitz’s L-15 medium | Gibco (Invitrogen) | 11415064 | |
| Fetal bovine serum | Gibco(Invitrogen) | 16000-036 | |
| Fetal equine serum | Fisher | SH3007402 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco (Invitrogen) | 15140163 | |
| 100% Ethanol | The Warner Graham Company | 64-17-5 | |
| Phosphate buffered saline solution, 10X, pH 7.4 | Quality Biological, inc. | 119-069-131 | 1X in sterile, distilled water |
| Biohazard bags | VWR | 14220-028 | |
| Haemocytometer | Hausser Scientific | 1492 | |
| 6-well cell culture plates with cellBIND surface | Corning | 3335 |
References
- Ransohoff, R. M., Perry, V. H. Microglial physiology: unique stimuli, specialized responses. Annu. Rev. Immunol. 27, 119-145 (2009).
- Raivich, G., Bohatschek, M., Kloss, C. U., Werner, A., Jones, L. L., Kreutzberg, G. W. Neuroglial activation repertoire in the injured brain: graded response, molecular mechanisms and cues to physiological function. Brain Res. Brain Res. Rev. 30, 77-105 (1999).
- Loane, D. J., Byrnes, K. R. Role of microglia in neurotrauma. Neurotherapeutics. 7, 245-265 (2010).
- Glass, C. K., Saijo, K., Winner, B., Marchetto, M. C., Gage, F. H. Mechanisms underlying inflammation in neurodegeneration. Cell. 140, 918-934 (2010).
- Pocock, J. M., Liddle, A. C. Microglial signalling cascades in neurodegenerative disease. Prog. Brain Res. 132, 555-565 (2001).
- Block, M. L., Hong, J. S. Chronic microglial activation and progressive dopaminergic neurotoxicity. Biochem. Soc. Trans. 35, 1127-1132 (2007).
- Barger, S. W., Basile, A. S. Activation of microglia by secreted amyloid percursor protein evokes release of glutamate by cystine exchange and attenuates synpatic function. J. Neurochem. 76, 846-854 (2001).
- Ni, M., Aschner, M. Neonatal rat primary microglia: isolation, culturing, and selected applications. Curr. Protoc. Toxicol. Chapter 12, Unit 12.17 (2010).
- Hassan, N. F., Rifat, S., Campbell, D. E., McCawley, L. J., Douglas, S. D. Isolation and flow cytometric characterization of newborn mouse brain-derived microglia maintained in vitro. J. Leukoc. Biol. 50, 86-92 (1991).
- Hassan, N. F., Prakash, K., Chehimi, J., McCawley, L. J., Douglas, S. D. Isolation and characterization of newborn rabbit brain-derived microglia. Clin. Immunol. Immunopathol. 59, 426-435 (1991).
- Hassan, N. F., Campbell, D. E., Rifat, S., Douglas, S. D. Isolation and characterization of human fetal brain-derived microglia in in vitro culture. Neuroscience. 41, 149-158 (1991).
- Frank, M. G., Wieseler-Frank, J. L., Watkins, L. R., Maier, S. F. Rapid isolation of highly enriched and quiescent microglia from adult rat hippocampus: immunophenotypic and functional characteristics. J. Neurosci. Methods. 151, 121-130 (2006).
- Byrnes, K. R., Stoica, B., Loane, D. J., Riccio, A., Davis, M. I., Faden, A. I. Metabotropic glutamate receptor 5 activation inhibits microglial associated inflammation and neurotoxicity. Glia. 57, 550-560 (2009).
- Loane, D. J., Stoica, B. A., Pajoohesh-Ganji, A., Byrnes, K. R., Faden, A. I. Activation of metabotropic glutamate receptor 5 modulates microglial reactivity and neurotoxicity by inhibiting NADPH oxidase. J. Biol. Chem. 284, 15629-15639 (2009).
