La croissance de la Mycobacterium tuberculosis Les biofilms

Résumé

Mycobacterium tuberculosis forme des biofilms de drogues tolérantes quand elles sont cultivées dans certaines conditions. Nous décrivons ici les méthodes de culture, M. biofilms tuberculose et la détermination de la fréquence des persistants de drogue tolérante. Ces protocoles seront utiles pour d'autres études sur les mécanismes de la tolérance au médicament chez M. la tuberculose.

Résumé

Mycobacterium tuberculosis, l'agent étiologique de la tuberculose humaine, a une capacité extraordinaire de survivre contre les stress environnementaux, notamment des antibiotiques. Bien que la tolérance au stress de M. la tuberculose est l'une des contributeurs susceptibles à la chimiothérapie de 6 mois à long de la tuberculose ^1, les mécanismes moléculaires qui sous-tendent ce phénotype caractéristique de l'agent pathogène restent floues. Beaucoup d'espèces microbiennes ont évolué pour survivre dans des environnements stressants par auto-assemblage en très organisée, la surface fixée, et la matrice des structures encapsulées appelé biofilms ^2-4. La croissance dans les collectivités qui semble être une stratégie de survie préféré des microbes, et est réalisé grâce à des composants génétiques qui régulent la surface de fixation, les communications intercellulaires, et la synthèse de substances polymériques extracellulaires (EPS) ^5,6. La tolérance au stress environnemental est probablement facilité par EPS, et peut-être par le physiol'adaptation logique de bacilles individu à microenvironnements hétérogènes au sein de l'architecture complexe des biofilms ^7.

Dans une série d'articles récents, nous avons établi que M. la tuberculose et le Mycobacterium smegmatis ont une forte propension à se développer dans des structures multicellulaires organisés, appelés biofilms, qui peuvent tolérer plus de 50 fois les concentrations minimales inhibitrices des médicaments anti-tuberculeux isoniazide et ^8-10 rifampicine. M. la tuberculose, cependant, nécessite curieusement conditions spécifiques à former des biofilms matures, en particulier de rapport de 9:01 espace de tête: les médias ainsi que l'échange limité de l'air avec l'atmosphère ^9. Exigences de conditions environnementales spécialisées pourrait être lié au fait que M. la tuberculose est un agent pathogène obligatoire humaine et a donc adapté aux environnements de tissus. Dans cette publication, nous la démonstration de méthodes de culture de M. tuberculosebiofilms dans une bouteille et un format de plaque à 12 puits, ce qui est pratique pour les études bactériologiques ainsi que génétiques. Nous avons décrit le protocole d'une souche atténuée de M. la tuberculose, mc ² 7000, avec la suppression dans les deux locus, panCD et RD1, qui sont cruciaux pour la croissance in vivo de la ⁹ pathogène. Cette souche peut être utilisé sans danger dans une enceinte BSL-2 pour la compréhension de la biologie de base de l'agent pathogène tuberculose évitant ainsi l'exigence d'un coûteux BSL-3 installation. La méthode peut être étendue, moyennant des modifications appropriées dans les médias, à se développer un biofilm d'autres espèces de mycobactéries cultivables.

Dans l'ensemble, un protocole uniforme de biofilms culture mycobactérienne aidera les enquêteurs s'intéressent à l'étude des caractéristiques de base élastiques de mycobactéries. En outre, une méthode claire et concise de la croissance des biofilms mycobactériens aidera également le inv clinique et pharmaceutiqueestigators pour tester l'efficacité d'un médicament potentiel.

Protocole

1. Biofilms plus en plus de M. la tuberculose dans une bouteille de 250 mL vis plafonné

1. La préparation des médias: Dissoudre 0,5 g de KH ₂ PO _4, 0,5 g de MgSO _4, 4 g de L-asparagine, 2g d'acide citrique, 0,05 g de citrate d'ammonium ferrique, 60mL de glycérol dans 900 ml d'eau. Ajuster le pH à 7,0 avec NaOH. Autoclave, frais et juste avant de commencer l'expérience, ajouter stérile ZnSO ₄ à une concentration finale de 0,1% p / v Depuis mc ² 7000 est un auxotrophe pantothénate cette souche nécessite également de l'acide pantothénique à 10μg/mL de concentration final....

Discussion

La tuberculose (TB), causée par l'infection de Mycobacterium tuberculosis, demeure une menace majeure pour la santé publique mondiale. Près d'un tiers de la population mondiale est estimée à asymptomatique infecté par l'agent pathogène, environ 9 millions de nouveaux cas apparaissent chaque année dans la clinique avec des symptômes de tuberculose évolutive et environ 1,7 million de personnes meurent de l'infection chaque année ^11. Le lourd fardeau de la maladie est principalement cont.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Incubateur	VWR international	Modèle n° 1923/25
Bouteilles de culture en polystyrène	Fisher Scientific	03-374-300
Plaque de culture tissulaire à 12 puits	VWR international	62406-165
Tubes coniques de 50 mL	VWR international	89039-660
Agitateur rotatif	Thermo Fisher Scientific, Inc.	57019-662
Frigo chromatographique	VWR international	55702-520
Boîte de Pétri	VWR international	25384-342
KH2PO4 (monobasique)	EMD Millipore	PX1565-1
MgSO4	Fisher Scientific	M65-500
L-asparagine	Sigma-Aldrich	A4284-100G
Acide citrique	Sigma-Aldrich	C1857-100G
Citrate d'ammonium ferrique	Sigma-Aldrich	F5879-100G
Glycérol	EMD Millipore	GX0185-5
NaOH	Sigma-Aldrich	S8045-500G
ZnSO4	Sigma-Aldrich	Z4750-500G
Acide D-pantothénique	Sigma-Aldrich	P2250-25G
Bouillon Difco Middlebrook 7H9	BD Biosciences	271310
Enrichissement Middlebrook OADC	BBL	212351
Tween-80	Fisher Scientific	T164-500
Bouteille de stockage de 250 mL	Corning	430281
Plaques à 12 puits	Falcon BD	353043
Rifampicine	Sigma-Aldrich	R3501-1G
Méthanol	JT Baker	9070-05
Seringue de 10 mL	BD Biosciences	301604
Pointes de pipette de 1-200μL	VWR international	89079-458
Parafilm M	VWR international	PM-996
Tube centrifuge de 15 mL	Greiner Bio-One	188-285
Agar Difco Mycobacteria 7H11	BD Biosciences	283810
NaCl	Fisher Scientific	BP358-1
KCl	Sigma-Aldrich	P9333-500G
Na2HPO4 (dibasique)	Sigma-Aldrich	S0876-500G