三维自组装肽水凝胶中人类神经前体细胞的培养

摘要

本文描述了利用自组装三维支架培养人类神经前体细胞的方法。我们提供了一种从支架中释放细胞的方案，以便后续对细胞进行分析，例如通过流式细胞术。该方案可适用于其他细胞类型，以开展深入的机制性研究。

摘要

为了探索神经系统疾病或神经退行性疾病中基于细胞的标准化治疗方法，研究三维（3D）支架对细胞生长、增殖以及最终神经元分化的影响具有重要意义。相较于二维培养，三维结构被认为能够提供更接近体内环境的培养条件。在再生医学领域，将生物材料支架与神经干细胞及前体细胞相结合，展现出巨大的治疗潜力^1-5。已有研究表明，模拟三维环境的培养系统可影响多种干细胞和前体细胞的增殖与分化。其中，三维微环境的构建与功能化对于决定包埋细胞的存活状态及其命运至关重要^6-8。本研究采用PuraMatrix^9,10（RADA16，PM），这是一种基于多肽的水凝胶支架，已被广泛描述并用于研究三维环境对不同类型细胞的影响^7,11-14。PuraMatrix易于定制，其纳米纤维为人工合成，所提供的三维培养系统具有高度可靠性，且不含异源成分。

最近，我们研究了PM浓度对支架结构形成的影响¹³。在本研究中，所使用的PM浓度直接影响了三维结构的形成，这一结果通过原子力显微镜得以证实。随后对人神经前体细胞（hNPCs）的存活与分化情况进行分析，发现所用PM浓度对包埋细胞的命运具有影响。然而，通过免疫荧光技术对细胞存活或神经元分化进行分析时存在一些困难。为了获得可靠的数据，必须确定基质内细胞的总数，从而计算出由βIII-微管蛋白标记的神经元细胞等特定细胞类型的相对数量。这就要求采用共聚焦显微镜或能够获取样品z轴层扫描图像的荧光显微镜等类似技术，对支架进行三维分析。此外，此类分析极为耗时。

本文展示了一种从3D支架中释放细胞的方法，以便后续进行分析，例如流式细胞术。在本实验方案中，人神经前体细胞（hNPCs）ReNcell VM细胞系（Millipore USA）在由PuraMatrix（PM）或添加了层粘连蛋白的PuraMatrix（PML）构成的3D支架中进行培养和分化。据我们经验，0.25%的PM浓度最适合细胞培养¹³，但该浓度可根据其他细胞类型进行调整¹²。释放后的细胞可用于免疫细胞化学研究，并进一步通过流式细胞术进行分析。该方法可加快分析速度，更重要的是，所得数据基于更广泛的样本基础，从而提高了数据的可靠性。

方案

1. 第1部分：在PuraMatrix中培养人神经前体细胞（hNPCs）

1. 在制备浓度为0.25%且不含层粘连蛋白的PuraMatrix支架之前，需预先配制以下溶液
2. 配制含有20%蔗糖和含有10%蔗糖的溶液，均用无菌蒸馏水溶解。
3. 对于溶液1，取120 μl 20%蔗糖溶液与120 μl蒸馏水在1.5 ml锥形管中混合。
4. 对于溶液2，取60 μl PuraMatrix溶液与60 μl 20%蔗糖溶液在1.5 ml锥形管中混合。

制备含有层粘连蛋白（每100 μl基质含8 μg）且PuraMatrix浓度为0.25%的支架时，需准备以下溶液。

1. 配制溶液1：在1.5 ml锥形管中加入72 μl蒸馏水、120 μl 20%蔗糖溶液和48 μl层粘连蛋白。
2. 配制溶液2：在1.5 ml锥形管中混合60 μl PuraMatrix溶液与60 μl 20%蔗糖溶液。

5. 对于将细胞包埋于PuraMatrix中，需准备一个4孔细胞培养板，并在其中两个孔中放置灭菌的玻璃盖玻片（直径13 mm）。将培养板存放于超净工作台中以备后续使用。玻璃盖玻片仅用于免疫细胞化学研究。若不进行免疫细胞化学染色，此步骤可省略。

讨论

使用三维支架为研究不同类型细胞在更接近体内环境的细胞培养条件下的发育提供了机会。然而，在进行神经元分化分析或功能性研究时，必须克服一些障碍，才能获得可靠的定量细胞类型等数据。

本文描述了在基于多肽水凝胶PuraMatrix的支架中培养人神经前体细胞（hNPCs），以及随后将细胞释放用于二维条件下的研究，从而便于使用FACS或功能检测等工具。近期，我们通过原子力显微镜证明了PuraMatrix浓度对三维支架形成的影响，并研究了其对细胞存活和分化的作用。¹³ 然而需要注意的是，不同细胞类型可能需要不同的培养条件，或由其他材料（如Matrigel或胶原蛋白）构成的基质。

细胞释放的方案基于制造商提供的方案¹⁸ 其方法可与制备原代神经元培养物的常规方案相比较，即首先通过机械法分离细胞，随后利用酶消化去除周围组织成分。细胞对此处理过程具有良好的耐受性，保持活性，并重新长出突起，当再次接种于层粘连蛋白（laminin）包被的表面时，可表达神经元标志物如βIII-微管蛋白。本研究.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
PuraMatrix 肽水凝胶	BD 生物科学	354250
小鼠层粘连蛋白 I	Cultrex	400-2009090
蔗糖	Sigma-Aldrich	S9378-1KG
正常山羊血清	Dako	X0907
Triton X-100	卡尔罗斯特有限责任公司	3051.3
PBS Dulbecco	Biochrom AG	L 1825
HBSS	GIBCO，隶属于 Life Technologies	14170-088	汉克斯’ 平衡盐溶液 1X
βIII-tubulin 抗体	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	Sc-51670	小鼠，单克隆，1:500
Alexa Fluor 488	Invitrogen	A 11029	山羊 α 小鼠，1:1000
Alexa Fluor 568	Invitrogen	A 11031	山羊 α 小鼠，1:1000
Alexa Fluor 647	Invitrogen	A 21235	山羊 α 小鼠，1:1000
Mowiol 4-88 试剂	Calbiochem	475904
Dabco	Aldrich	D2,780-2	1,4-二氮杂二环[2.2.2]辛烷 98%
细胞筛	BD 生物科学	352350	70 μm 孔径大小
皂苷	默克 & Co., Inc.	7695
胰蛋白酶/EDTA	GIBCO，隶属于 Life Technologies	25300-054
Benzonase 250 U/μl	默克 & Co., Inc.	1.01654.0001
胰蛋白酶抑制剂	Sigma-Aldrich	T6522（500 mg）
20% HSA	Octapharma	人血清白蛋白 Kabi 20%