में थर्मल Nociception मूल्यांकन की स्थानीय और वैश्विक तरीके<em> ड्रोसोफिला</em> लार्वा
Summary
इस अनुच्छेद में, हम assays में थर्मल nociception अध्ययन को दिखाना है<em> ड्रोसोफिला</em> लार्वा. एक परख थर्मल nociceptors की स्थानिक प्रतिबंधित (स्थानीय) उत्तेजना शामिल<sup1,2></sup> जबकि दूसरे सबसे अधिक के एक थोक (वैश्विक) सक्रियण या ऐसे सभी न्यूरॉन्स शामिल<sup> 3</sup>. साथ में, इन तकनीकों और व्यवहार कार्यों का दृश्य मात्रा का ठहराव की अनुमति<em> ड्रोसोफिला</em> Nociceptive संवेदी न्यूरॉन्स.
Abstract
In this article, we demonstrate assays to study thermal nociception in Drosophila larvae. One assay involves spatially-restricted (local) stimulation of thermal nociceptors1,2 while the second involves a wholesale (global) activation of most or all such neurons3. Together, these techniques allow visualization and quantification of the behavioral functions of Drosophila nociceptive sensory neurons.
The Drosophila larva is an established model system to study thermal nociception, a sensory response to potentially harmful temperatures that is evolutionarily conserved across species1,2. The advantages of Drosophila for such studies are the relative simplicity of its nervous system and the sophistication of the genetic techniques that can be used to dissect the molecular basis of the underlying biology4-6 In Drosophila, as in all metazoans, the response to noxious thermal stimuli generally involves a “nocifensive” aversive withdrawal to the presented stimulus7. Such stimuli are detected through free nerve endings or nociceptors and the amplitude of the organismal response depends on the number of nociceptors receiving the noxious stimulus8. In Drosophila, it is the class IV dendritic arborization sensory neurons that detect noxious thermal and mechanical stimuli9 in addition to their recently discovered role as photoreceptors10. These neurons, which have been very well studied at the developmental level, arborize over the barrier epidermal sheet and make contacts with nearly all epidermal cells11,12. The single axon of each class IV neuron projects into the ventral nerve cord of the central nervous system11 where they may connect to second-order neurons that project to the brain.
Under baseline conditions, nociceptive sensory neurons will not fire until a relatively high threshold is reached. The assays described here allow the investigator to quantify baseline behavioral responses or, presumably, the sensitization that ensues following tissue damage. Each assay provokes distinct but related locomotory behavioral responses to noxious thermal stimuli and permits the researcher to visualize and quantify various aspects of thermal nociception in Drosophila larvae. The assays can be applied to larvae of desired genotypes or to larvae raised under different environmental conditions that might impact nociception. Since thermal nociception is conserved across species, the findings gleaned from genetic dissection in Drosophila will likely inform our understanding of thermal nociception in other species, including vertebrates.
Protocol
Discussion
यहाँ वर्णित assays के लिए गुणात्मक और मात्रात्मक थर्मल उत्तेजनाओं के लिए हानिकारक प्रतिक्रिया के लिए अलग जीनोटाइप का लार्वा का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. गर्मी की जांच परख की एक मुख्य विशेषता यह है कि प्रेरणा एक ही ठिकाना पर ही दिया जाता है. यह शायद केवल चतुर्थ श्रेणी न्यूरॉन्स खंड में जांच से संपर्क के एक छोटे सबसेट है और शायद तुरंत आसन्न 11 क्षेत्रों में उन की गोलीबारी जाता है. स्थानीय उत्तेजना की वजह से, गर्मी जांच परख हानिकारक उत्तेजना है कि एक हाथ एक गर्म स्टोव से संपर्क के रूप में क्षेत्र इस तरह के एक विशेष शरीर के लिए स्थानीय है का पता लगाने के आम संवेदी अनुभव mimics. गर्मी जांच परख का एक नुकसान यह है कि यह कुछ परिवर्तनशीलता उपयोगकर्ता के लिए उपयोगकर्ता की संभावना है कि तीन कारकों को जिम्मेदार ठहराया जा सकता है: मैं) के दबाव के साथ जो उपयोगकर्ता लार्वा की जांच लागू होता है, ii) जांच के सटीक स्थान अंतर्निहित nociceptive न्यूरॉन्स, और, iii) सटीक आंग के सापेक्ष लार्वा परजो लार्वा की जांच सतह संपर्क पर ले.
हम पहले गैर responders, धीमी गति से responders, और तेजी से responders उनकी वापसी विलंबता पर किसी दिए गए एक तापमान करने के लिए आधारित में वर्गीकृत लार्वा की मात्रात्मक रणनीति की सूचना दी. यहाँ हम भी उच्च तापमान के लार्वा जवाबदेही पर रिपोर्ट. दिलचस्प है, हम पाते हैं कि लार्वा थर्मल nociceptive प्रतिक्रियाओं के लिए एक छत है और कि यह छत 52 और 54 के बीच स्थित डिग्री सेल्सियस यह लार्वा कि एक क्षणिक रिसेप्टर (टीआरपी) क्षमता 52 से अधिक तापमान पर gating के लिए सक्षम चैनल डिग्री सेल्सियस के पास नहीं है का संकेत हो सकता है वैकल्पिक रूप से, यह सुझाव है कि सकता है कि इस्तेमाल किया न्यूरॉन्स या मांसपेशियों को आरंभ करने के लिए या बाहर ले जाने के लिए मोटर प्रतिक्रिया क्षतिग्रस्त हो गया है इससे पहले कि वे भी अपवर्ती वापसी में कार्य कर सकते हैं. हम भी वापसी के आयाम का एक अलग विश्लेषण प्रतिक्रिया का उपयोग करने के लिए प्रतिक्रिया की मजबूती "का एक संकेतक के रूप में या तो रोल की संख्या की रिपोर्ट. एक naively,उम्मीद है कि इन मापदंडों को बढ़ाने या उत्तेजना के तापमान और समय के साथ वृद्धि होगी. हैरानी की बात है, हम पाते हैं कि यह मामला नहीं है. लार्वा हानिकारक सीमा (42 डिग्री सेल्सियस) के अंत में कम तापमान पर एक लंबे समय के लिए प्रेरित अधिक रोल दिखाने के लिए और अधिक समय खर्च रोलिंग से लार्वा उच्च तापमान (48-52 डिग्री सेल्सियस) पर जांच. यह पता चलता है कि हानिकारक तापमान खिड़की के भीतर यह मुख्य रूप से जोखिम है कि प्रतिक्रिया के आयाम निर्धारित करता है की अवधि है. चूंकि लार्वा अत्यधिक हानिकारक तापमान के उजागर करने के लिए (48-52 ° सी) के औसत पर बहुत जल्दी जवाब है, वे समय की एक लंबी लंबाई के लिए कम हानिकारक तापमान उजागर करने के लिए लार्वा के रूप में कई रोल के रूप में प्रदर्शन नहीं करते हैं. यहां बताया प्रतिक्रिया आयाम के विश्लेषण एक मात्रात्मक आयाम है जो साथ अलग जीनोटाइप या पर्यावरण जोड़तोड़ की तुलना में किया जा सकता है कहते हैं.
गर्मी प्लेट परख की एक मुख्य विशेषता है कि यह हानिकारक के लिए एक वैश्विक जोखिम शामिल हैगर्मी. जैसे, यह एक गर्म स्टोव छू से एक गर्म कड़ाही में बैठे पशु जैसा है. हालांकि यह स्पष्ट नहीं है जब एक लार्वा प्रयोगशाला इस वैश्विक जोखिम के व्यवहार प्रतिक्रियाओं स्थानीय उत्तेजना पर मनाया उन लोगों की तुलना में अधिक जटिल कर रहे हैं में जंगली में एक विश्व स्तर पर हानिकारक उत्तेजना का अनुभव हो सकता है. गर्मी प्लेट परख की ताकत, 3 अन्य लोगों द्वारा भी उल्लेख किया, यह है कि यह थोड़ा उपयोगकर्ता के लिए उपयोगकर्ता परिवर्तनशीलता के बाद से लार्वा छू प्रोटोकॉल के एक घटक नहीं है. केवल पर्याप्त विचरण परिभाषित जब प्रत्येक व्यवहार के शुरू और यह दोहराया देखने / परिचित के साथ कम किया जा सकता है में किया जा रहा है. Assays के बीच एक दिलचस्प अंतर तापमान जिस पर प्रतिकूल व्यवहार शुरू की है. ये बहुत गर्मी जांच के साथ की तुलना में गर्मी प्लेट परख में कम कर रहे हैं. प्रारंभिक गर्मी जांच (सिर और पूंछ बढ़ा) के साथ संपर्क लार्वा द्वारा प्रदर्शित व्यवहार हो सकता है एक सिर गर्मी बेनी ° C से 27 ~ मनाया पिटाई की सहसंबंधीई परख. यह संभव है कि इस प्रतिक्रिया "दर्द" से अधिक "असुविधा" को दर्शाता है. हम सजा, जब्ती के सहसंबंधी, और उच्च में भी पक्षाघात नहीं देखा है (48 डिग्री सेल्सियस) गर्मी जांच परख में तापमान और यह हो सकता है कि शरीर के एक से अधिक क्षेत्र से गोलीबारी संवेदी न्यूरॉन के एक महत्वपूर्ण जन है इन व्यवहार पर लाने की जरूरत है. Nociceptive गर्मी का संकेत है कि वैश्विक उत्तेजना neuronal प्रतिक्रिया है कि अपर्याप्त हैं संक्षेप शामिल करने के लिए स्थानीय के साथ व्यवहार को गति प्रदान कर सकते हैं जांच के साथ मनाया सीमा के निचले अंत के नीचे दिलचस्प है, जब्ती और पक्षाघात व्यवहार तापमान (37 डिग्री सेल्सियस ~ 34) में मनाया जाता है गर्मी की जांच के आवेदन. कि इन तापमान वास्तव में लार्वा के लिए हानिकारक के रूप में माना जाता है अवलोकन है कि लार्वा कि पक्षाघात व्यवहार शुरू कर रहे हैं और बाद में उड़ भोजन पर ठीक करने की अनुमति दी ज्यादातर मामलों में नहीं जीवित रहने के (चित्रा 5C) द्वारा समर्थित है. आगे तर्क का समर्थन है कि गर्मी plखाया परख nociceptive प्रतिक्रियाओं को पढ़ रही है तथ्य यह है कि ज्ञात nociceptive संवेदी न्यूरॉन्स में synaptic संचरण को रोकने के लिए मनाया व्यवहार (चित्रा 6) की सबसे की विलंबता बढ़ता है. अवलोकन है कि उच्च तापमान सजा व्यवहार के लिए विलंबता में कोई वृद्धि से पता चलता है कि इस व्यवहार के लिए अन्य संवेदी न्यूरॉन्स कि MD-Gal4 व्यक्त नहीं की आवश्यकता हो सकती है.
स्थानीय और वैश्विक परख में तेजी से गर्म पानी की एक बूंद में परख विसर्जन में एक छोटे से धातु जांच के गर्म टिप – संक्षेप में, दोनों assays के परिभाषित तापमान के हानिकारक थर्मल उत्तेजना के लिए एक व्यक्ति के लार्वा को उजागर शामिल है. आनुवंशिक पृष्ठभूमि और / अलग या पर्यावरण की स्थिति (उदाहरण प्लस या माइनस ऊतकों को नुकसान के लिए) को अलग करने के लिए संपर्क के ड्रोसोफिला लार्वा के व्यवहार प्रतिक्रियाओं, और अध्ययन किया जा सकता है इन assays का उपयोग मात्रा. अंत में, इन assays के परिणाम हमें बेहतर आनुवंशिक अनापत्ति प्रमाणपत्र को नियंत्रित नेटवर्क को समझने में मदद मिलेगीड्रोसोफिला और अन्य संबंधित प्रजातियों में iception.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम ईसाई Landry गर्मी जांच, डैनियल Babcock पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए गर्मी प्लेट परख, ब्लूमिंगटन ड्रोसोफिला स्टॉक केंद्र मक्खी शेयरों के लिए, और Galko प्रयोगशाला के सदस्यों के सुझाव के लिए लार्वा गर्मी जांच परख, शॉन स्वीनी के विकास के लिए डिजाइन के लिए धन्यवाद. यह काम MJG और अल्पसंख्यक अनुसंधान कॅरिअर (औसत) के लिए उपयोग करने के लिए एक NIH मार्क U स्टार प्रशिक्षण अनुदान (T34GM079088 ह्यूस्टन डाउनटाउन विद्वान अकादमी के विश्वविद्यालय के लिए) R01 NS069828 NIH द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Thermal Probe | Pro-Dev Engineering | Custom-built on demand | Contact information can be provided on request |
| Dry Bath Incubator | Fisher Scientific | 11-718 | 1 solid heating block and 1 heating block with 16mm wells |
| Leica DFC290 12v/400mA Color camera |
Leica Microsystems | 12730080 | Any equivalent camera will do. |
| Leica MZ6 microscope | Leica Microsystems | Part number for MZ6 zoom body (optics carrier) is 10445614 | |
| Schott Ace Modulamp Unit | Schott North America, Inc. | A20500 | |
| Schott Dual Gooseneck 23 inch Fiber Optic Light Guide | Schott North America, Inc. | Schott A08575 | |
| Thermal Control Unit | TSCI corp. | Custom Built | Details can be provided on request |
| Zeiss Stemi 2000 microscope | Zeiss | NT55-605 | Any equivalent microscope will do. |
| Forceps | FST | FS-1670 | |
| 1mm mesh | Genesee Scientific | 57-101 | |
| Paintbrush | Dick Blick Art Materials | 06762-1002 | |
| UV crosslinker | Fisher Scientific | 1199289 | |
| Coplin Jars | Fisher Scientific | 08-816 | |
| 10ml beaker | Fisher Scientific | 02-540C | |
| Diethyl ether | Fisher Scientific | E138-500 | |
| 35 X 10 mm Polystyrene Petri Dish | Falcon | 351008 | We have not tested alternative dishes. |
| Glass Microscope Slide | Corning | 26003 | |
| Thermocouple | Omega Engineering, Inc. | HH802U | |
| Piece of vinyl | Office Depot | 480009 | |
| Microcentrifuge tube | Denville Scientific Inc. | C-2170 |
References
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