מדידת Chemotaxis סלולרי עם ECIS / מוניות
Summary
מערכת ECIS / מוניות היא אוטומטית, בזמן אמת assay המודד chemotaxis סלולריים. ב assay זה, התאים לעבור מתחת לשכבה של agarose להגיע האלקטרודה היעד. התנועה נייד נמדדת הופעת עמידות 0 AC הנוכחי.
Abstract
התנועה נייד בתגובה לגירויים חיצוניים חיונית תהליכים תאיים רבים, כולל ריפוי פצעים, דלקות כתגובה לזיהום. השיטה הנפוצה היא למדוד chemotaxis assay קאמרית בוידן, שבו תאים chemoattractant מופרדים על ידי קרום נקבובי. כמו תאים נודדים דרך הממברנה אל chemoattractant, הם דבקים התחתון של הקרום, או נפילה לתוך התקשורת הבסיסיים, והם מוכתמים מכן וספר חזותית 1. בשיטה זו, התאים נחשפים שיפוע תלול chemoattractant חולף, אשר נחשב ייצוג ירודה של הדרגתיים נמצאו ברקמות 2.
עוד מערכת assay, תחת agarose chemotaxis assay, 3, 4 צעדים תנועת התא על פני מצע מוצק בסרט מימית דק שיוצר מתחת לשכבת agarose. שיפוע שמתפתח agarose שטחית נחשב Appropriate ייצוג טבעי הדרגתיים. Chemotaxis ניתן להעריך על ידי הדמיה מיקרוסקופית של המרחק. שניהם assay קאמרית בוידן ו-assay תחת agarose מוגדרים בדרך כלל מבחני נקודות קצה.
מערכת אוטומטית ECIS / מוניות משלבת את הגישה מתחת agarose עם החשמל Cell-המצע התנגדות חישה (ECIS) 5, 6. ב assay זה, אלקטרודות היעד נמצאים כל אחד 8 חדרים. גדול נגד האלקטרודה עובר כל אחד 8 חדרים (איור 2). כל חדר מלא agarose ושתי בארות קטנים הם קיצוץ agarose משני צדי האלקטרודה היעד. אחד גם הוא מלא עם האוכלוסייה התא הבדיקה, ואילו השני מחזיק את מקורות chemoattractant לשדר (איור 3). הנוכחי עבר דרך המערכת יכולה לשמש כדי לקבוע את השינוי בהתנגדות המתרחשת כאשר תאים עוברים על האלקטרודה היעד. תאים על היעד electrodדואר להגביר את ההתנגדות של המערכת 6. כמו כן, תנודות מהירים ההתנגדות מייצגים שינוי יחסי הגומלין של התאים עם משטח האלקטרודה מעידים על שינויים מתמשכים צורה סלולריים. מערכת ECIS / מוניות יכולים למדוד את התנועה של האוכלוסייה התא בזמן אמת על פני פרקי זמן ארוכים, אבל גם רגיש מספיק כדי לזהות את בואם של תא בודד על האלקטרודה היעד.
Dictyostelium discoidium ידוע להעביר בנוכחות חומצה פולית שיפוע 7, 8 ו chemotactic התגובה שלו ניתן למדוד באופן מדויק על ידי ECIS / 9 מוניות. Chemotaxis ליקוציט, בתגובה SDF1α וגם היריבים chemotaxis יש גם למדוד עם ECIS / 10 מוניות, 11. למשל התגובה ליקוציט כדי SDF1α מוצג באיור 1.
Protocol
Discussion
מאפיינים חדשים של assay ECIS / מוניות כוללים את יכולתה להפוך אוסף של נתונים בזמן אמת כמו תאים להגיב chemoattractant. תוך יישום נפוץ ביותר של טכנולוגיה זו היא למדוד תגובות הסלולר הדרגתיים chemotactic בודדים, או הדרגתיים המורכבות תערובות של אגוניסטים chemotaxis ואת היריבים, הגישה ECIS / מוניות …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמוסד הלאומי לבריאות (ES07408 ו EB00208).
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalog number | Comments |
| ECIS Zθ | Applied Biophysics | http://www.biophysics.com/prodducts_Ecisz0.php | |
| ECIS Electrode Array | Applied Biophysics | 8W Chemotaxis | http://www.biophysics.com/cultureware.php |
| Seakem GTG agarose | BioWhittaker Molecular Applications | 50070 | |
| RPMI1640 | Cellgro | 10-040 | |
| HyClone Fetal Bovine Serum | Thermo Scientific | SH300703 | |
| Penicillin/Streptomycin | MP Biomedicals | 1670049 | Penicillin 5,000 IU/ml; Streptomycin 5 mg/ml |
| HEPES Buffer | MP Biomedicals | 1688449 | 1M solution, cell culture grade |
| 14 Gauge stainless steel Cannula (2) 4 inch | General Laboratory Supply | 5-8365-1 | Blunt point |
References
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J. Exp. Med. 115, 453-466 (1962).
- Lauffenburger, D. A., Tranquillo, R. T., Zigmond, S. H. Concentration gradients of chemotactic factors in chemotaxis assays. Methods Enzymol. 162, 85-101 (1988).
- Nelson, R. D., Quie, P. G., Simmons, R. L. Chemotaxis under agarose: a new and simple method for measuring chemotaxis and spontaneous migration of human polymorphonuclear leukocytes and monocytes. J. Immunol. 115, 1650-1650 (1975).
- Newton-Nash, D. K., Tonellato, P., Swiersz, M., Abramoff, P. Assessment of chemokinetic behavior of inflammatory lung macrophages in a linear under-agarose assay. J. Leukoc. Biol. 48, 297-305 (1990).
- Giaever, I., Keese, C. R. Monitoring fibroblast behavior in tissue culture with an applied electric field. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 3761-374 (1984).
- Keese, C. G. I. A Whole Cell Biosensor bsed on Cell-Substrate Interactions. IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. 12, 500-501 (1990).
- Laevsky, G., Knecht, D. A. Cross-linking of actin filaments by myosin II is a major contributor to cortical integrity and cell motility in restrictive environments. J. Cell. Sci. 116, 3761-3770 (2003).
- Condeelis, J., Bresnick, A., Demma, M., Dharmawardhane, S., Eddy, R., Hall, A. L., Sauterer, R., Warren, V. Mechanisms of amoeboid chemotaxis: an evaluation of the cortical expansion. 11, 5-6 (1990).
- Hadjout, N., Laevsky, G., Knecht, D. A., Lynes, M. A. Automated real-time measurement of chemotactic cell motility. Biotechniques. 31, 1130-1138 (2001).
- Hadjout, N., Yin, X., Knecht, D. A., Lynes, M. A. Automated real-time measurements of leukocyte chemotaxis. J. Immunol. Methods. 320, 70-80 (2007).
- Yin, X., Knecht, D. A., Lynes, M. A. Metallothionein mediates leukocyte chemotaxis. BMC Immunol. 6, 21-21 (2005).
- Lundien, M. C., Mohammed, K. A., Nasreen, N., Tepper, R. S., Hardwick, J. A., Sanders, K. L., Van Horn, R. D., Antony, V. B. Induction of MCP-1 expression in airway epithelial cells: role of CCR2 receptor in airway epithelial injury. J. Clin. Immunol. 22, 144-152 (2002).
- Zudaire, E., Cuesta, N., Murty, V. The aryl hydrocarbon receptor repressor is a putative tumor suppressor gene in multiple human cancers. J. Clin. Invest. 118, 640-650 (2008).
- Opp, D., Wafula, B., Lim, J., Huang, E., Lo, J. C., Lo, C. M. Use of electric cell-substrate impedance sensing to assess in vitro cytotoxicity. Biosens. Bioelectron. 24, 2625-269 (2009).
- Foxman, E. F., Kunkel, E. J., Butcher, E. C. Integrating conflicting chemotactic signals. The role of memory in leukocyte navigation. J. Cell. Biol. 147, 577-588 (1999).
- Heit, B., Tavener, S., Raharjo, E., Kubes, P. An intracellular signaling hierarchy determines direction of migration in opposing chemotactic gradients. J. Cell. Biol. 159, 91-102 (1999).
