Multiphoton Mikroskopi av Rensat mushjärna uttrycker YFP
Summary
Multiphoton mikroskopi av hela mus organ är möjlig genom optiskt rensa organet före avbildning, men inte alla protokoll bevara fluorescenssignalen av fluorescerande proteiner. Använda en optisk clearing metod med etanol-baserad uttorkning och bensylalkohol: bensylbensoat clearing visar vi högupplösta multiphoton bilder av hela mushjärna uttrycker YFP.
Abstract
Multiphoton mikroskopi av inneboende fluorescens och andra harmoniska generationen (SHG) av hela mus organ möjliggörs genom optiskt rensa organet före avbildning. 1,2 För organ som innehåller fluorescerande proteiner såsom GFP och YFP, optiska clearing protokoll som använder metanol uttorkning och tydlig med användande av bensylalkohol: bensylbensoat (BABB) medan oskyddad från ljus 3 inte bevarar inte den fluorescerande signalen. Protokollet presenteras här är ett nytt sätt för att utföra hela organ optisk clearing på mushjärna samtidigt som fluorescenssignalen av YFP uttryckt i nervceller. Ändra de optiska clearing-protokollet så att orgeln är uttorkad med en etanol graderad serie har visat sig minska skadorna på de fluorescerande proteiner och bevara sin fluorescerande signal för multiphoton avbildning. 4 Använda en optimerad metod för optisk clearing med etanol-baserad uttorkning och clearing av BABBmedan skyddad från ljus, visar vi högupplösta multiphoton bilder av gula fluorescerande protein (YFP) uttryck i nervceller i en mushjärna mer än 2 mm under vävnadsytan.
Protocol
Discussion
Medan vanliga organiska färgämnen är kompatibla med en rad olika organiska lösningsmedel och därför inte utgör en särskild utmaning för att rensa protokoll, fluorescerande proteiner är ofta mindre toleranta mot förändringar i lösningsmedel. 4 Målet för föreliggande arbete var att övervinna en allvarlig begränsning av tidigare optiska clearing protokoll där fluorescens XFPs förlorades eller allvarligt skadad. De bilder som presenteras här visar att fluorescens från YFP bevarades. Den opti…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vill tacka Jacob Solis för hans hjälp i videoredigering.
Detta arbete har finansierats delvis av en NSF KARRIÄR Award DBI-0953902 till MJ Levene.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich, Inc. | D8537 | 500 ml, pH 7.2 |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | 10 x 10 ml, 16% paraformaldehyde |
| Ethyl alcohol | American Bioanalytical | AB00515-00500 | 500 ml, 200 proof |
| Ethyl alcohol | Pharmco Products, Inc. | 111000190 | 1 gal., 190 proof |
| Benzyl alcohol | Sigma-Aldrich, Inc. | 402834 | 500 ml, 99+% |
| Benzyl benzoate | Sigma-Aldrich, Inc. | B6630-IL | 500 ml, ≥ 99% |
| 5X/0.5 NA objective | Nikon | AZ Plan Flour 5X | 15 WD |
References
- Parra, S. G., Chia, T. H., Zinter, J. P., Levene, M. J. Multiphoton microscopy of cleared mouse organs. J. Biomed. Opt. 15, 036017 (2010).
- Vesuna, S., Torres, R., Levene, M. J. Multiphoton fluorescence, second harmonic generation, and fluorescence lifetime imaging of whole cleared mouse organs. J. Biomed. Opt. 16, 106009 (2011).
- Zucker, R. M. Whole insect and mammalian embryo imaging with confocal microscopy: Morphology and apoptosis. Cytometry. A69, 1143-1152 (2006).
- Sakhalkar, H. S. Functional imaging in bulk tissue specimens using optical emission tomography: Fluorescence preservation during optical clearing. Phys. Med. Biol. 52, 2035-2054 (2007).
- Dazai, J., Spring, S., Cahill, L. S., Henkelman, R. M. Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging. J. Vis. Exp. (48), e2497 (2011).
- Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes. Biomed. Eng. Online. 2, (2003).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. . The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2001).
- Abramoff, M. D., Magelhaes, P. J., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophotonics International. 11, 36-42 (2004).
- Feng, G., Mellor, R. H., Bernstein, M., Keller-Peck, C., Nguyen, Q. T., Wallace, M., Nerbonne, J. M., Lichtman, J. W., Sanes, J. R. Imaging Neuronal Subsets in Transgenic Mice Expressing Multiple Spectral Variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
- Hama, H. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat. Neuro. 14, 1481-1488 (2011).
