Tüm fare organların Multiphoton mikroskobu optik görüntüleme öncesi organı temizleyerek mümkün değil, tüm protokolleri floresan proteinlerin floresan sinyal korumak. Etanol bazlı dehidratasyon ve benzil alkol ile optik temizleme yöntemi: benzil benzoat takas, biz bütün fare beyin YFP ifade yüksek çözünürlüklü multiphoton görüntüleri göstermek.
Abstract
Tüm fare organlarının içsel floresans ve ikinci harmonik üretimi (SHG) arasında Multiphoton mikroskobu optik görüntüleme öncesi organı temizleyerek mümkün olmaktadır. 1,2 Ancak, GFP ve YFP olarak floresan proteinleri içeren organlar, metanol kullanan optik temizleme protokollerinin benzil alkol kullanarak dehidratasyon ve net: ışık 3 korumasız ise benzil benzoat (Babb) floresan sinyal korumak yok. Burada sunulan protokol nöronlarda eksprese YFP floresan sinyal koruyarak fare beyni üzerindeki tüm organ optik temizleme gerçekleştirmek için hangi yeni bir yoludur. Org floresan protein için hasarı azaltmak ve multiphoton görüntüleme için onların floresan sinyalini korumak için yararlı olan bir dizi dereceli etanol kullanılarak susuz olduğu bu tür optik açıklığa protokol değiştirilmesi. 4 etanol-tabanlı dehidrasyon ile optik açıklığın iyileştirilmiş bir yöntem ile Babb ile takasışıktan korumalı ise, biz doku yüzeyinin altında 2 mm'den daha fazla bir fare beyin nöronları sarı floresan proteini (YFP) İfade yüksek çözünürlüklü multiphoton görüntüleri göstermek.
Protocol
1. Hayvan Perfüzyon 5 ve Whole Fare Beyin Takas Işlemin tüm uzunluğu boyunca kurutma aşaması için kullanılan süre uzunluğuna bağlı olarak değişebilir, fakat toplam tüm süreç iki gün içinde gerçekleştirilebilmektedir. YFP fareler tartılır ve daha sonra derin bir ketamin / ksilazin (100 mg / kg: 10 mg / kg) intraperitoneal enjeksiyon ile anestetize. Ameliyat öncesinde derin anestezi cerrahi bir düzlem onaylayın. Hayvan bir firma parmak veya kuyruk tutam t…
Discussion
Standart organik boyalar organik çözücülerin bir yelpazesi ile uyumlu ve bu nedenle protokoller temizlemek için özel bir sorun teşkil etmez iken, floresan proteinleri çözücü sıklıkla değişiklikler az hoşgörülü. Mevcut çalışma 4 hedefi ciddi bir sınırlama üstesinden oldu XFPs floresan kayıp veya ölçüde düşer Bir önceki optik temizleme protokolleri. Burada sunulan görüntüler YFP gelen floresans korunmuş olduğunu göstermektedir. Burada anlatılan optik temizleme tekniği dok…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz video düzenleme yaptığı yardım için Jacob Solis teşekkür etmek istiyorum.
Bu çalışma MJ Levene bir NSF KARİYER Ödülü DBI-0953902 tarafından finanse edildi.
Parra, S. G., Vesuna, S. S., Murray, T. A., Levene, M. J. Multiphoton Microscopy of Cleared Mouse Brain Expressing YFP. J. Vis. Exp. (67), e3848, doi:10.3791/3848 (2012).