La calidad de fibroblastos de embriones de ratón (MEFs) está dictada por la cepa derecha de ratón tal como CF-1. Pluripotencia-MEFs de apoyo y medios de comunicación condicionado (CM) obtenido a partir de éstas debe contener concentraciones óptimas de activina A, Gremlin y Tgfβ1 necesarios para la Activina / Nodal y las vías de FGF de manera cooperativa mantener la auto-renovación y pluripotencialidad.
En general, las células madre embrionarias humanas (hESCs) y humanos células madre pluripotentes inducidas (hiPSCs) 1 pueden ser cultivadas bajo condiciones variables. Sin embargo, no es fácil establecer un sistema eficaz para el cultivo de estas células. Dado que las condiciones de cultivo pueden influir en la expresión del gen que confiere la pluripotencia de hESCs y hiPSCs, la optimización y estandarización del método de cultivo es crucial.
El establecimiento de líneas de células madre se describió por primera vez mediante MEFs como células alimentadoras y suero bovino fetal (FBS)-que contiene medio de cultivo 2. A continuación, FBS fue reemplazado con el reemplazo de octavos de final del suero (KSR) y FGF2, lo que aumenta la proliferación de hESCs 3. Finalmente, libres de conexión sistemas de cultivo de permitir el cultivo de células en Matrigel placas recubiertas en KSR-contiene medio condicionado (medio condicionado por MEFs) 4. Posteriormente, las condiciones de cultivo de células madre embrionarias humanas han avanzado hacia la alimentación libre de la cultura en la defi químicamenteed 5-7 condiciones. Además, para evitar la contaminación potencial por patógenos y proteínas animales métodos de cultivo utilizando xeno componentes libres se han establecido 8.
Para obtener mejores condiciones de células de ratón alimentadoras han sido sustituidos con líneas celulares humanas (por ejemplo, músculo y células de la piel del feto 9, las células adultas de la piel 10, fibroblastos de prepucio 11-12, amnióticas células mesenquimales 13). Sin embargo, la eficacia de mantener hESCs indiferenciados utilizando prepucio humano derivados de fibroblastos capas alimentadoras no es tan alta como la de células alimentadoras de ratón debido al nivel inferior de la secreción de activina A 14. Obviamente, hay una diferencia evidente en la producción del factor de crecimiento por células de ratón y humanos alimentadoras.
Los análisis de los transcriptomes de ratón y células humanas de alimentación reveló diferencias significativas entre las células de apoyo y no de apoyo. Exógenos FGF2 es crucial para manteNing auto-renovación de hESCs y hiPSCs, y ha sido identificado como un factor clave en la regulación de la expresión de Tgfβ1, Una activina y Gremlin (un antagonista de BMP) en células alimentadoras. Activina A se ha demostrado que induce la expresión de Oct4, Sox2, y Nanog en hESCs 15-16.
A largo plazo la cultura, y hESCs hiPSCs se puede cultivar en mitóticamente inactivados MEFs o bajo condiciones libres de conexión en el MEF-CM (MEF medio condicionado) en Matrigel placas recubiertas para mantener su estado indiferenciado. El éxito de las dos condiciones de cultivo depende totalmente de la calidad de las células de alimentación, ya que afectan directamente el crecimiento de hESCs.
A continuación, presentamos un algoritmo optimizado para el aislamiento y cultivo de fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs), la preparación de medio condicionado (MC) y ligado a enzimas (ELISA) para evaluar los niveles de activina A en los medios de comunicación.
El procedimiento de aislamiento MEFs presentado aquí permite el establecimiento de una condición de cultivo estandarizado para hESCs y hiPSCs. Además, el sistema basado en ELISA utilizado para evaluar la producción de citocinas por células alimentadoras es un indicador útil de la calidad de los medios condicionados MEF-derivados. El mantenimiento de rutina de la cepa de ratón (CF1) proporcionar fibroblastos de apoyo es necesario para evitar lote a lote variación de medios de cultivo. Además, se recomienda para aislar embriones de varios ratones simultáneamente para obtener una calidad uniforme de las células. Ciertamente, recién aisladas MEFs se puede mantener congelada a P0 y P1. También inactiva MEFs se puede mantener congelado en alícuotas de las cantidades apropiadas dependiendo de los requerimientos para el cultivo celular. Por lo general, alrededor de 250.000 células deben ser cultivadas en un solo pozo de una placa de 6 pocillos de hESCs cultura y las células iPS. El método establecido y optimizados pueden ser usados rutinariamente para minimizar la variabilidad entre los difealquiler de experimentos.
The authors have nothing to disclose.
Un agradecimiento especial al Dr. Boris Greber para la creación de la activina un protocolo de ELISA que se publica en Greber et al. De 2007. Estamos especialmente agradecidos a la Sra. Mónica Shevack para preparar el resumen gráfico. Estamos muy agradecidos al Dr. Heiko Fuchs por toda la ayuda y sus valiosas sugerencias antes y durante el rodaje. Nos gustaría dar las gracias a todos los miembros del laboratorio de Adjaye, especialmente Elisabeth Socha para mantener un suministro constante de MEFs y CM. También agradecemos a nuestros colegas en las instalaciones de los animales de la MPIMG por su apoyo permanente. Este trabajo fue financiado en parte por la Sociedad Max Planck y el [BMBF, el número de concesión 0315717A], los socios de la ERASysBio + iniciativa apoyada en la UE ERA-NET Plus esquema en el 7PM.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
DMEM (High Glucose) | Gibco, Invitrogen | 41966-052 | |
FBS | Biochrom | S0115 | |
L-glutamine | Gibco, Invitrogen | 25030-024 | |
Penicillin-streptomycin | Gibco, Invitrogen | 15140-122 | |
Vacuum filter system | Corning | 431097 | 500 ml, 0.22 μm, PAS |
DMSO | Sigma | D2650 | |
Knockout DMEM | Gibco, Invitrogen | 10829-018 | |
Knockout Serum Replacement | Gibco, Invitrogen | 10828-028 | |
Non-Essential Amino Acids | Gibco, Invitrogen | 11140-035 | |
beta-Mercaptoethanol | Sigma | M7522 | |
PBS | Gibco, Invitrogen | 14190-169 | |
DNase I | Sigma | D4527 | |
Mitomycin C | Roche | 10107409001 | |
Basic Fibroblast Growth Factor | PeproTech | 100-18B | |
Biotinylated Anti-human/mouse/rat Activin A Antibody | R&D Systems | BAM3381 | |
Gelatin | Sigma | G9391 | |
Human/Mouse/Rat Activin A MAb | R&D Systems | MAB3381 | |
0.05% Trypsin-EDTA | Gibco, Invitrogen | 25300-054 | |
Extra Thin Iris Scissors | FST | 14088-10 | |
Extra Fine Graefe Forceps | FST | 11150-10 | |
Pierse Fixation Forceps | FST | 18155-13 |