Epitel hücreleri 3-D hücre toplam oluşumu ile sonuçlanarak, fizyolojik koşullar altında büyüyebilir olanak sağlayan bir döner hücre kültürü sistemi tarif edilmektedir. Agregalar ekran üretilen In vivo-Gibi özellikleri, geleneksel kültür modellerinde gözlenen ve bilimsel araştırmalar bir çok için daha doğru bir organotipik model sistem olarak hizmet edemez.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Kültüre ve Duvar Gemi Biyoreaktör Döner Uygulamaları 3D Epitel Hücre Modelleri Türetilmiş
Bu makalede
Özet
Özet
Hücreler ve beden deneyim kendi mimari etkileyen çevre koşulları, hücreler arası iletişim, ve genel fonksiyonları doku. In vitro hücre kültür modelleri doğru ilgi doku taklit etmek için, kültürün büyüme ortamı göz önünde kritik bir yönüdür. Yaygın olarak kullanılan geleneksel bir hücre kültüründe düz (2-D) iki boyutlu bir geçirimsiz yüzeyler üzerinde epitel hücreler yayar. Çok konvansiyonel sistemlerin hücre kültürü öğrenilebilir olmasına rağmen, birçok bulgular, potansiyel olarak, fizyolojik olarak ilgili mikro eksikliği bir sonucu olarak, insan klinik denemeler ya da doku eksplantlarında tekrarlanabilir değildir.
Burada, yenilikçi döner duvar damar (RWV) çoğaltıldığı teknolojiyi kullanarak, 2-B hücre kültürlerinin kültür durumu sınırları çok aşan bir kültür sistemi tanımlar. Biz ve diğerleri organotipik RWV kaynaklı modeller structur recapitulate göstermiştire, fonksiyon ve benzer insan eksplant dokuları 1-6, dış uyaranlara otantik insan yanıtları. RWV biyoreaktör düşük fizyolojik koşullar altında sıvı kayma epitel hücre büyümesi için izin veren bir süspansiyon kültürü sistemidir. Biyoreaktörler iki farklı formatta, yüksek boy dönen damar (HARV) veya onların havalandırma kaynağına göre farklılık gösteren bir yavaş dönüm yanal damar (STLV) gelir. Epitel hücreleri gözenekli, kolajen-kaplı boncukların microcarrier (Şekil 1A) ile kombinasyon halinde tercih biyoreaktör eklenir. Hücreler biyoreaktör içinde sürekli serbest düşme (Şekil 1B) sırasında bir büyüme iskelesi olarak boncuk kullanıyoruz. Biyoreaktör tarafından sağlanan mikro hücrelerinin çoğu zaman, standart 2-D kültürü koşulları (Şekil 1B) altında gözlenmez vivo benzeri özellikleri gösteren (3-D) üç boyutlu bir agregatlar oluşturması için olanak sağlar. Bu özellikler sıkı kavşaklar, muc dahilin vivo protein lokalizasyonu, ve ek epitel hücre türüne özgü özelliklerini bize üretim, bazal / apikal yönlendirme,.
Tamamen farklılaşmış 3-D agrega için epitel hücrelerinin bir tek tabaka gelen ilerleme hücre tipi 1, 7-13 göre değişir. Biyoreaktör gelen Periyodik örnekleme epitel agregat oluşumunu, hücresel farklılaşma işaretleri ve canlılık (Şekil 1D) izlenmesine olanak sağlar. Bir kez hücre farklılaşması ve toplam oluşumu kurulduğunda, hücreler hasat biyoreaktör, ve benzer deneyler 2-D hücreleri üzerinde gerçekleştirilen bir kaç hususlar (Şekil 1E-G) ile 3-D agregalar uygulanabilir edilir. Bu çalışmada, biz nasıl kültür RWV biyoreaktör sisteminde 3-D epitel hücre agrega ve 3-D agrega ile yürütülebilecek bu potansiyeli testleri ve analizleri çeşitli. Ayrıntılı adımlar tarif Bu analizler, bunlarla m / yapısal, bunlarla sınırlı değildirorphological analizi (konfokal, tarama ve transmisyon elektron mikroskobu), sitokin / kemokin sekresyon ve hücre sinyal (sitometrik boncuk dizisi ve Western blot analizi), gen ekspresyon analizi (real-time PCR), ilaç / toksikolojik analiz ve konak-patojen. Bu testlerin kullanımı gibi metabolomik, transkriptomik, proteomik ve diğer dizi tabanlı uygulamalar gibi daha derin ve geniş çalışmalar için temel ayarlayın. Amacımız çeşitli bilimsel çıkarları ile araştırmacılar tarafından kullanılmak üzere, basit bir ve sağlam bir sistem, in vivo doku insan recapitulate organotipik 3-D modeller üretmek için kültür, insan epitel hücrelerinin bir konvansiyonel olmayan yollarla sunmaktır.
Protokol
Tüm adımlar Laminar akış kaputu BSL-2 şartlarda yapılmalıdır.
1. STLV Biyoreaktör hazırlanması
- Üretici protokolüne göre STLV biyoreaktör kurma ve biyoreaktör sterilite sağlamak için detoksifikasyon protokolü gerçekleştirin. Luer kapaklar ile açık portları kapsar ve 24 saat süreyle% 95 etanol ile STLV doldurun.
- Etanol çıkarın ve 24 saat için steril saf su ile STLV doldurun.
- Sadece steril distile su ile 1.2 adımı yineleyin.
- Satıcı tarafından sağlanan araç ile, bir sterilizasyon kese içinde 20 dakika süreyle 110 ° C'de tüm vidaları, kapaklar ve merkezi fiş STLV gelen ve otoklav gevşetin.
- ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Burada sunulan RWV biyoreaktör teknoloji kullanımı daha fizyolojik ilgili organotipik hücre kültürü modeli mevcut hücre kültürü sistemini ilerletmek için yeteneği ile araştırmacılar sağlayabilir. RWV biyoreaktör hücre kültür sistemi sıkı kavşaklar, müsin üretimi, hücre dışı işlemler (yani mikrovilluslar) ve hücresel polarite dahil in vivo benzeri özellikleri de olan 3-D hücresel agregatlar oluşturması için hücreler sağlar düşük kayma mikro sağlar. Burada sunulan veri ve örneklerin çoğunluğu RWV sistemi.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Teşekkürler
Yazarlar onun protein analizi için onu teknik uzmanlık ve Andrew Larsen için Brooke Hjelm teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma Alternatifleri Araştırma Geliştirme Vakfı (MMHK) Grant ve NIH NIAID Cinsel Yolla Bulaşan Enfeksiyonlar ve Topikal mikrobisitler Kooperatif Araştırma Merkezi IU19 AI062150-01 (MMHK) tarafından kısmen finanse edildi. Biz minnetle rakamlar yeniden kullanım için Üremenin Biyolojisi kabul etmiş sayılırsınız.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Reaktif Adı | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
| Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21131 | 1:500 titrede el |
| FACSDiva | BD | Akış sitometresi | |
| β-tublin antikoru | Calbiochem | 654162 | 1:5000 dilüsyon el |
| Bio-Plex 2000 | BioRad | 171-000205 | v5 yazılım |
| Biyoreaktör ve bileşenler | Synthecon | RCC-4 | |
| Hücre süzgeç | BD Falcon | 352340 | 40μm gözenek boyutu |
| Konik tüpü (50 mL) | Corning | 5-538-60 | |
| Lameller | VWR | 48366067 | |
| Sitokin boncuk dizisi kitleri | BioRad | Özel insan kiti | |
| Cytodex boncuk | Sigma | C3275 | |
| DPBS | Gibco | 14190 | |
| EDTA | Sigma | ED-500G | Etilendiamintetraasetik asit |
| Epitel spesifik antikor (ESA) | Chemicon | CBL251 | 01:50 dilusyondaki el |
| Fetal bovin serumu (FBS) | Gibco | 10438 | Inaktif Isı |
| HARV (Tek) | Synthecon | D-405 | |
| Hidroklorik asit | Sigma | 258148 | % 37 |
| Involukrin antikor | Sigma | Ben 9018 | |
| Mikroskop slaytlar | VWR | 16004-368 | |
| MTT ayıracı | MP Biomedicals, LLC | 194592 | 3 - (4,5-Dimethylthiazolyl 1-2) -2,5-Difenil Tetrazolium Bromür |
| MUC1 antikoru (mikroskopisi) | Santa Cruz | Sc-7313 | 01:50 dilusyondaki el |
| MUC1 antikor (akım sitometri) | BD Pharmingen | 559774 | Ayrıca CD227 adı verilen, test başına 20μL kullanın |
| Paraformaldehyde | Elektron Mikroskopi Bilimleri | 15710 | DPBS% 4 oranında seyreltilmiş |
| Petri (küçük) | BD Falcon | 353002 | |
| Filtre ile Polistiren tüp | BD Falcon | 352235 | |
| Polistiren olugu | BD Falcon | 352058 | |
| PR antikor | DAKO | M3569 | 1:100 de el |
| Altın Prolong | Invitrogen | P36931 | DAPI ile montaj medya |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74903 | |
| Sodyum dodesil sülfat | Sigma | 71725 | |
| Sterilizasyon çantası | VWR | 11213-035 | |
| Stopcocks (tek yönlü) | Medex | MX5061L | |
| Şırınganın (10 mL) | BD | 309604 | Luer kilit ipucu |
| Şırınganın (5 mL) | BD | 309603 | Luer kilit ipucu |
| Tripan Mavi | Invitrogen | T10282 | |
| VP5 antikor | Santa Cruz | sc-13525 | HSV-2 antikoru Clone 6F10; 1:5000 dilüsyon kullanılan |
Kaynaklar
- Herbst-Kralovetz, M. M., et al. Quantification and comparison of toll-like receptor expression and responsiveness in primary and immortalized human female lower genital tract epithelia. Am. J. Reprod. Immunol. 59 (3), 212-224 (2008).
- Hjelm, B. E., Berta, A. N., Nickerson, C. A., Arntzen, C. J., Herbst-Kralovetz, M. M.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
