Epitel hücreleri 3-D hücre toplam oluşumu ile sonuçlanarak, fizyolojik koşullar altında büyüyebilir olanak sağlayan bir döner hücre kültürü sistemi tarif edilmektedir. Agregalar ekran üretilen<em> In vivo</em>-Gibi özellikleri, geleneksel kültür modellerinde gözlenen ve bilimsel araştırmalar bir çok için daha doğru bir organotipik model sistem olarak hizmet edemez.
Hücreler ve beden deneyim kendi mimari etkileyen çevre koşulları, hücreler arası iletişim, ve genel fonksiyonları doku. In vitro hücre kültür modelleri doğru ilgi doku taklit etmek için, kültürün büyüme ortamı göz önünde kritik bir yönüdür. Yaygın olarak kullanılan geleneksel bir hücre kültüründe düz (2-D) iki boyutlu bir geçirimsiz yüzeyler üzerinde epitel hücreler yayar. Çok konvansiyonel sistemlerin hücre kültürü öğrenilebilir olmasına rağmen, birçok bulgular, potansiyel olarak, fizyolojik olarak ilgili mikro eksikliği bir sonucu olarak, insan klinik denemeler ya da doku eksplantlarında tekrarlanabilir değildir.
Burada, yenilikçi döner duvar damar (RWV) çoğaltıldığı teknolojiyi kullanarak, 2-B hücre kültürlerinin kültür durumu sınırları çok aşan bir kültür sistemi tanımlar. Biz ve diğerleri organotipik RWV kaynaklı modeller structur recapitulate göstermiştire, fonksiyon ve benzer insan eksplant dokuları 1-6, dış uyaranlara otantik insan yanıtları. RWV biyoreaktör düşük fizyolojik koşullar altında sıvı kayma epitel hücre büyümesi için izin veren bir süspansiyon kültürü sistemidir. Biyoreaktörler iki farklı formatta, yüksek boy dönen damar (HARV) veya onların havalandırma kaynağına göre farklılık gösteren bir yavaş dönüm yanal damar (STLV) gelir. Epitel hücreleri gözenekli, kolajen-kaplı boncukların microcarrier (Şekil 1A) ile kombinasyon halinde tercih biyoreaktör eklenir. Hücreler biyoreaktör içinde sürekli serbest düşme (Şekil 1B) sırasında bir büyüme iskelesi olarak boncuk kullanıyoruz. Biyoreaktör tarafından sağlanan mikro hücrelerinin çoğu zaman, standart 2-D kültürü koşulları (Şekil 1B) altında gözlenmez vivo benzeri özellikleri gösteren (3-D) üç boyutlu bir agregatlar oluşturması için olanak sağlar. Bu özellikler sıkı kavşaklar, muc dahilin vivo protein lokalizasyonu, ve ek epitel hücre türüne özgü özelliklerini bize üretim, bazal / apikal yönlendirme,.
Tamamen farklılaşmış 3-D agrega için epitel hücrelerinin bir tek tabaka gelen ilerleme hücre tipi 1, 7-13 göre değişir. Biyoreaktör gelen Periyodik örnekleme epitel agregat oluşumunu, hücresel farklılaşma işaretleri ve canlılık (Şekil 1D) izlenmesine olanak sağlar. Bir kez hücre farklılaşması ve toplam oluşumu kurulduğunda, hücreler hasat biyoreaktör, ve benzer deneyler 2-D hücreleri üzerinde gerçekleştirilen bir kaç hususlar (Şekil 1E-G) ile 3-D agregalar uygulanabilir edilir. Bu çalışmada, biz nasıl kültür RWV biyoreaktör sisteminde 3-D epitel hücre agrega ve 3-D agrega ile yürütülebilecek bu potansiyeli testleri ve analizleri çeşitli. Ayrıntılı adımlar tarif Bu analizler, bunlarla m / yapısal, bunlarla sınırlı değildirorphological analizi (konfokal, tarama ve transmisyon elektron mikroskobu), sitokin / kemokin sekresyon ve hücre sinyal (sitometrik boncuk dizisi ve Western blot analizi), gen ekspresyon analizi (real-time PCR), ilaç / toksikolojik analiz ve konak-patojen. Bu testlerin kullanımı gibi metabolomik, transkriptomik, proteomik ve diğer dizi tabanlı uygulamalar gibi daha derin ve geniş çalışmalar için temel ayarlayın. Amacımız çeşitli bilimsel çıkarları ile araştırmacılar tarafından kullanılmak üzere, basit bir ve sağlam bir sistem, in vivo doku insan recapitulate organotipik 3-D modeller üretmek için kültür, insan epitel hücrelerinin bir konvansiyonel olmayan yollarla sunmaktır.
Burada sunulan RWV biyoreaktör teknoloji kullanımı daha fizyolojik ilgili organotipik hücre kültürü modeli mevcut hücre kültürü sistemini ilerletmek için yeteneği ile araştırmacılar sağlayabilir. RWV biyoreaktör hücre kültür sistemi sıkı kavşaklar, müsin üretimi, hücre dışı işlemler (yani mikrovilluslar) ve hücresel polarite dahil in vivo benzeri özellikleri de olan 3-D hücresel agregatlar oluşturması için hücreler sağlar düşük kayma mikro sağlar. Burada sunul…
The authors have nothing to disclose.
Yazarlar onun protein analizi için onu teknik uzmanlık ve Andrew Larsen için Brooke Hjelm teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma Alternatifleri Araştırma Geliştirme Vakfı (MMHK) Grant ve NIH NIAID Cinsel Yolla Bulaşan Enfeksiyonlar ve Topikal mikrobisitler Kooperatif Araştırma Merkezi IU19 AI062150-01 (MMHK) tarafından kısmen finanse edildi. Biz minnetle rakamlar yeniden kullanım için Üremenin Biyolojisi kabul etmiş sayılırsınız.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21131 | Used at 1:500 dilution |
FACSDiva | BD | Flow cytometer | |
β-tublin antibody | Calbiochem | 654162 | Used at 1:5000 dilution |
Bio-Plex 2000 | BioRad | 171-000205 | v5 software |
Bioreactor and components | Synthecon | RCCS-4 | |
Cell strainer | BD Falcon | 352340 | 40μm pore size |
Conical tube (50mL) | Corning | 5-538-60 | |
Coverslips | VWR | 48366067 | |
Cytokine bead array kits | BioRad | Custom human kit | |
Cytodex beads | Sigma | C3275 | |
DPBS | Gibco | 14190 | |
EDTA | Sigma | ED-500G | Ethylenediaminetetraacetic acid |
Epithelial specific antibody (ESA) | Chemicon | CBL251 | Used at 1:50 dilution |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10438 | Heat inactivated |
HARV (Disposable) | Synthecon | D-405 | |
Hydrochloric acid | Sigma | 258148 | 37% |
Involucrin antibody | Sigma | I 9018 | |
Microscope slides | VWR | 16004-368 | |
MTT reagent | MP Biomedicals, LLC | 194592 | 3-(4,5-Dimethylthiazolyl 1-2)-2,5-Diphenyl Tetrazolium Bromide |
MUC1 antibody (microscopy) | Santa Cruz | Sc-7313 | Used at 1:50 dilution |
MUC1 antibody (flow cytometry) | BD Pharmingen | 559774 | Also called CD227, use 20μL per test |
Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Diluted to 4% in DPBS |
Petri dish (small) | BD Falcon | 353002 | |
Polystyrene tube with filter | BD Falcon | 352235 | |
Polystyrene flow tube | BD Falcon | 352058 | |
PR antibody | DAKO | M3569 | Used at 1:100 dilution |
ProLong Gold | Invitrogen | P36931 | Mounting media with DAPI |
RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74903 | |
Sodium dodecyl sulfate | Sigma | 71725 | |
Sterilization pouch | VWR | 11213-035 | |
Stopcocks (one-way) | Medex | MX5061L | |
Syringe (10mL) | BD | 309604 | Luer-lock tip |
Syringe (5mL) | BD | 309603 | Luer-lock tip |
Trypan Blue | Invitrogen | T10282 | |
Vp5 antibody | Santa Cruz | sc-13525 | HSV-2 antibody Clone 6F10; used at 1:5000 dilution |