الكمية بوليميريز سلسلة من ردود الفعل في الوقت الحقيقي (qPCR) هو وسيلة سريعة وحساسة للتحقيق في مستويات التعبير عن مختلف microRNA (ميرنا) الجزيئات في عينات الورم. ويمكن استخدام هذا التعبير أسلوب مئات من جزيئات ميرنا مختلفة يتم تضخيمها، كميا، وتحليلها من القالب نفسه [كدنا].
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
الكشف microRNA في أورام البروستات بواسطة PCR الوقت الحقيقي الكمية (qPCR)
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تُعد جزيئات الميكرو آر إن إيه (miRNAs) جزيئات حمض ريبي نووي (RNA) غير مشفرة، أحادية السلسلة، ويتراوح طولها بين 18 و24 نوكليوتيد. وهي تشارك في جميع العمليات الخلوية تقريباً، بما في ذلك النمو1، والموت الخلوي المبرمج (apoptosis)2، وتنظيم الدورة الخلوية3. وتُشير التقديرات إلى أن جزيئات miRNAs تنظم تعبير 30% إلى 90% من الجينات البشرية4 عن طريق الارتباط بجزيئات الحمض الريبي النووي المرسال (mRNAs) المستهدفة5. وقد تم الإبلاغ عن خلل واسع النطاق في تنظيم miRNAs في أمراض وأنواع فرعية مختلفة من السرطان6. ونظراً لانتشارها وبنيتها الفريدة، فمن المرجح أن تمثل هذه الجزيئات الصغيرة الجيل القادم من المؤشرات الحيوية، أو العوامل العلاجية، و/أو الأهداف الدوائية.
تشمل الطرق المستخدمة لاستقصاء تعبير miRNA تقنية qPCR القائمة على صبغة SYBR green I وكذلك التقنية القائمة على مسبار Taqman. ولكي تُستخدم miRNAs بفعالية في السياق السريري، فمن الضروري أن يكون الكشف عنها في العينات السريرية الطازجة و/أو المؤرشفة دقيقاً، وقابلاً للتكرار، ونوعياً. وقد استُخدمت تقنية qPCR على نطاق واسع للتحقق من تعبير miRNAs في تحليلات الجينوم الكامل مثل دراسات المصفوفات الدقيقة (microarray)7. كانت العينات المستخدمة في هذا البروتوكول من مرضى خضعوا لاستئصال جذري للبروستاتا لعلاج سرطان البروستاتا الموضعي سريرياً؛ ومع ذلك، يمكن استبدالها بأنسجة وخطوط خلوية أخرى. وقد تم تجميد عينات البروستاتا تجميداً سريعاً في النيتروجين السائل بعد الاستئصال. كما جُمعت المتغيرات السريرية ومعلومات المتابعة لكل مريض لإجراء التحليلات اللاحقة8.
تحديد كمية مستويات miRNA في عينات أورام البروستاتا. تتمثل الخطوات الرئيسية في تحليل qPCR للأورام فيما يلي: استخلاص RNA الكلي، وتخليق cDNA، والكشف عن نواتج qPCR باستخدام بادئات متخصصة لـ miRNA. تم استخلاص RNA الكلي، والذي يشمل mRNA و miRNA وأنواعًا أخرى من RNAs الصغيرة، من العينات باستخدام كاشف TRIzol. واستُخدم نظام miScript من شركة Qiagen لتخليق cDNA وإجراء qPCR (الشكل 1). ونظرًا لأن miRNAs الداخلية ليست مضافًا إليها عديد الأدينيلات (polyadenylated)، فإن إنزيم poly(A) polymerase يقوم بإضافة ذيول عديد الأدينيلات إلى miRNA خلال عملية النسخ العكسي. ويُستخدم miRNA كقالب لتخليق cDNA باستخدام oligo-dT وإنزيم Reverse Transcriptase. وتسهل تسلسلات الوسم الشاملة (universal tag) الموجودة على الطرف '5 لبادئات oligo-dT عملية تضخيم cDNA في خطوة PCR. ويتم الكشف عن تضخيم ناتج PCR من خلال مستوى الفلورة المنبعثة من SYBR Green، وهو صبغ يتخلل الحمض النووي DNA مزدوج الخيوط. وتقوم بادئات miRNA المتخصصة، جنباً إلى جنب مع بادئ شامل (Universal Primer) يرتبط بتسلسل الوسم الشامل، بتضخيم تسلسلات miRNA محددة.
تتوفر مقاييس بادئات miScript لأكثر من ألف من جزيئات miRNA الخاصة بالبشر، ومئات من جزيئات miRNA الخاصة بالفئران. وقد استُخدمت طريقة الكمية النسبية هنا لقياس مستوى تعبير جزيئات miRNA. ولتصحيح التباين بين العينات المختلفة، يتم ضبط مستويات تعبير miRNA المستهدف وفقًا لمستويات تعبير جين مرجعي. ويعد اختيار الجين الذي يتم بناءً عليه ضبط تعبير الأهداف أمرًا بالغ الأهمية في طريقة التحليل بالكمية النسبية. ومن الأمثلة على الجينات المرجعية المستخدمة عادةً في هذا السياق جزيئات RNA الصغيرة RNU6B وRNU44 وRNU48، حيث تُعتبر مستقرة التعبير في معظم العينات. وفي هذا البروتوكول، استُخدم RNU6B كجين مرجعي.
البروتوكول
1. البروستاتا جمع العينات
- جمع عينات من البروستاتا في وقت استئصال البروستاتا. توجه العينة باستخدام معالم التشريحية. ورسمت على البروستاتا والحويصلات المنوية على النحو التالي: حق أخضر الجانب، جانب اليسار الزرقاء.
- يتم أخذ القسم الوسطي عشوائية عرضية من البروستاتا عمودي على سطح المستقيم، مجمدة في النيتروجين السائل، وتخزينها في -80 درجة مئوية 9.
- شرائح من العينات المخزنة المصورة، الموجهة (الأمامية، الخلفية، اليمين واليسار)، quadrisected. يتم قطع المقاطع باستخدام ناظم البرد.
- وملطخة المقاطع مع H & E، واستعرض من قبل الطبيب الشرعي لتحديد وترسيم المناطق ورم مقابل طبيعي على الشرائح ملون وصورة المقابلة. وتستخدم المناطق ملحوظ كدليل للإشارة إلى المناطق التي لاستخراج أنسجة الورم من الذي سيتم استخراج الحمض النووي الريبي في الخطوات اللاحقة.
2. عزل الحمض النووي الريبي الإجمالية، بما فيها ميرنا، من العينات
- عينات من مكان البروستات المجمدة على الجليد الجافة ويشير الى صورة المرسومة، قطع جزء صغير من الورم البروستات (ما بين 50 الى 100 ملغ).
- تجانس الأنسجة السرطانية في البروستات 1 مل من الكاشف TRIzol. وتعتمد الكميات في الخطوات التالية على استعمال 1 مل من الكاشف TRIzol.
ملاحظة: نحن هنا قد استخدمت الكاشف TRIzol لاستخراج الحمض النووي الريبي، ويمكن أيضا مجموعات أخرى إلا أن عزل الحمض النووي الريبي الصغيرة التي تحتوي على الحمض النووي الريبي مجموع استخدامها.
- احتضان العينات المتجانس لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- إضافة 0.2 مل من الكلوروفورم إلى العينات وهزة بقوة لمدة 15 ثانية. احتضان العينات لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة، ثم أجهزة الطرد المركزي في 12000 XG لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية.
- نقل عديم اللون المرحلة المائية العليا لأنابيب جديدة، وإضافة 0.5 مل من الكحول الآيزوبروبيل.احتضان العينات لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة، ثم أجهزة الطرد المركزي في 12000 XG لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية.
- بعناية نضح طاف من دون إزعاج بيليه الذي يحتوي على الحمض النووي الريبي. غسل بيليه RNA مع 1 مل من الإيثانول بنسبة 75٪. دوامة العينة وإعادة الرواسب عن طريق الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في XG 7500 في 4 درجات مئوية.
- نضح بعناية وطاف والجافة وبيليه الحمض النووي الريبي لمدة 5-10 دقائق، والتأكد من الحمض النووي الريبي بيليه لم يجف تماما. في Nuclease خالية من المياه الملائمة لحجم بيليه إعادة حل. قياس تركيز الحمض النووي الريبي باستخدام مقياس الطيف الضوئي 1000 NanoDrop (الامتصاصية التدبير في 260 نانومتر و 280).
- التحقق من جودة وسلامة عينات الحمض النووي الريبي باستخدام اجيلنت Bioanalyzer.
3. عكس نسخ من الحمض النووي الريبي
- تم إجراء النسخ العكسي من الحمض النووي الريبي باستخدام miScript كيت النسخ العكسي وفقا لتعليمات الشركة الصانعة (QIAGEN). هذه المجموعة تضمعكس المنتسخة و(A) بوليميريز بولي. والواق RT miScript تشمل المغنيسيوم 2 +، dNTPs، بنسبة ضئيلة من DT الاشعال، والبادئات العشوائية.
- استخدام ما بين 10 و ص 1 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي لتجميع [كدنا]. في حالة استخدام أكثر من 1 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي، توسيع نطاق رد الفعل خطيا إلى حجم مناسب.
- إعداد مزيج الرئيسي الذي يحتوي على 5X miScript RT العازلة (4 ميكرولتر)، miScript ميكس النسخ العكسي (1 ميكرولتر)، والمياه ريبونوكلياز خالية لجلب ردود الفعل على الحجم النهائي من 20 ميكرولتر. وتشمل أيضا الحمض النووي الريبي قالب (حتى 1 ميكروغرام) في مزيج الرئيسي.
- احتضان هذه العينات لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة 37 مئوية تليها مباشرة عن طريق حضانة لمدة 5 دقائق عند 95 درجة مئوية. لا يمكن أن يؤديها هذه الخطوة في جهاز PCR، تسخين كتلة، أو ماء الاستحمام. Thermocyclers هي الطريقة الأنسب والأكثر دقة. تخزين [كدنا] على الجليد على المدى القصير، و -20 درجة مئوية لمدة التخزين على المدى الطويل.
4. توليد منحنى قياسي
- قبل experiment مع miRNAs الهدف، يتم إنشاء منحنى قياسي باستخدام cDNAs تركيزات المعروفة ضد نقاط العبور (اف ب) (الشكل 2).
- إعداد سلسلة من التخفيفات من 2 أضعاف و 10 ضعفا، و 50 أضعاف، أضعاف-250، و 1250 أضعاف [كدنا] الأصلي للنموذج الذي هو معروف لدينا تعبير كبير من الجينات اهتمامك.
- تشغيل PCR على النحو المحدد في المادة 5 "في الوقت الحقيقي PCR للكشف عن ميرنا"، مع التعديل الذي كدنا] في التخفيفات المسلسل ليس تخفيف ثابت 40X.
- لتحليل باستخدام البرمجيات RelQuant (روش) لإنشاء منحنى المعيار الخاص بك.
ملاحظة: يجب إنشاء منحنى جديد موحدة لكل جينة من الفائدة.
5. في الوقت الحقيقي PCR للكشف من ميرنا
- تم تنفيذ حقيقي PCR الوقت لmiRNAs باستخدام miScript SYBR الأخضر PCR كيت والفحص التمهيدي miScript وفقا لتعليمات الشركة الصانعة (QIAGEN). إعداد مزيج رئيسية تحتوي على2X QuantiTect SYBR الأخضر ميكس ماستر PCR، 10X miScript التمهيدي العالمي، 10X الفحص التمهيدي miScript، والمياه ريبونوكلياز خالية. إعداد مزيج الرئيسي لحجم رد فعل 20 ميكرولتر.
- والفحص التمهيدي هو محدد لميرنا من الفائدة. الى 10x إعادة الفحص التمهيدي miScript، منبذة القارورة لفترة وجيزة، وإضافة 550 ميكروليتر TE العازلة، ودرجة الحموضة 8.0. دوامة القارورة لفترة وجيزة لخلط والشعائل قسامة إلى أصغر وحدات التخزين، وتخزينها عند درجة حرارة -20 درجة مئوية. ويلزم اثنان الاشعال: الاشعال للجينات الهدف وهذا الجين هو مرجع RNU6B usedas الجين مرجع.
- يخفف من [كدنا] aliquots اضافية 40X وتخزين عند درجة حرارة -20 درجة مئوية.
- [كدنا] بمثابة قالب لPCR. استخدام 2 ميكرولتر من [كدنا] المخفف 40X والاستغناء إلى 20 ميكروليتر ضوء cycler الشعيرات الدموية (روش).
- إضافة 18 ميكرولتر من مزيج الرئيسي إلى كل شعري، وأجهزة الطرد المركزي باستخدام محول الشعرية.
- وضع الشعيرات الدموية في cycler في الوقت الحقيقي القائم الشعرية، مثل LightCycler 3.5 نظام PCR في الوقت الحقيقي مع شكل دائري 32-الشعرية.
- تشغيل البرنامج الدراجات PCR على النحو التالي:
لتفعيل البوليميراز HotStarTaq التي هي في 2X QuantiTect SYBR الأخضر ميكس ماستر PCR، قبل احتضان عند 95 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
تليها 50 دورة من:
تمسخ، 15 ثانية و 94 درجة مئوية؛
الصلب، 30 ثانية و 55 درجة مئوية؛
تمديد، 30 ثانية، و 70 درجة مئوية. - اختيار عينة ليكون تدريج، وتعيين قيمته هدف تطبيع إلى 1. قارن التعبير النسبية لميرنا في جميع العينات الأخرى إلى تدريج.
ملاحظة: ضمن دراسة، وينبغي استخدام نفس العينة معايرة للحفاظ على اتساق النتائج.
6. تحليل البيانات
- وصفت منحنيات التضخيم لردود الفعل PCR بالرسوم والصور وعدديا بواسطة الجزيئية الكيميائية الحيوية LightCycler إصدار برامج 3.5 (روش). قياس ردود الفعل في علامة التبويب "الكمي"، وهوالثانية وتصدير البيانات إلى ملف نصي.
- استيراد البيانات إلى برنامج التحليل RelQuant (روش) لتوليد نتائج القياس الكمي. استيراد ملفات منفصلة عن الجينات المستهدفة، والجينات المرجعية، والبيانات منحنى القياسية.
- تحديد موقف من المعاير لكل من الهدف والجينات مرجع. أيضا تحديد المواقف من العينات. وأعرب عن البيانات كهدف للرجوع نسبة من عينات مختلفة مقسوما على نسبة إشارة إلى هدف للتدريج. يستخدم منحنى معيار ولدت من قبل لميرنا وخاصة الجينات التدبير المنزلي كمعيار مرجعي لاستقراء البيانات الكمية للأهداف ميرنا تركيزات غير معروف.
- ثلاث نسخ مكررة من تحليل العينات كمجموعة ويعني يحسب تركيزات والانحرافات المعيارية من ثلاث نسخ. إذا كان أحد triplicates غير متناسقة مع بقية المجموعة، سوف يتم استبعاده من قبل البرنامج.
7. ممثل النتائج
<ويرد ف الطبقة = "jove_content"> مثال لتحليل qPCR على عينات من البروستاتا في الشكل 3. وصفت النتائج عدديا، وكذلك بالرسوم والصور. الرسوم البيانية التي تبين مستويات التعبير عن الجينات إشارة، U6، تبدأ التضخيم الهائل في حوالي 20 دورة، في حين أن التعبير عن الجينات المستهدفة، ومير 98، وأظهرت تأخر ما يقرب من التضخيم في دورة 25. وقد تم تصدير البيانات من هذه التجربة في ملف نص وتحليلها بواسطة برنامج التحليل RelQuant. يتم تحديد المواقف من الشعيرات الدموية التي تحتوي على تدريج والعينات. الشكل 4 يوضح كيف يتم تعيين تدريج لكي تكون 1، والتعبير عن عينات أخرى بالنسبة للتدريج.
الشكل 1. الخطوات المختلفة في miScript العكسية النسخ والاسترداد في الوقت الحقيقي.
الشكل 2. يتم إنشاء منحنى قياسي باستخدام سلسلة من التخفيفات من 2 أضعاف و 10 ضعفا، و 50 أضعاف، أضعاف-250، و 1250 أضعاف العينة الأصلي [كدنا].
الشكل 3. روش LightCycler الكيميائية الحيوية الجزيئية برامج يظهر المعلومات الكاملة من التجربة بالرسوم والصور والنص من قبل. وتظهر زيادة كمية التضخيم PCR في الوقت الحقيقي والمؤامرات في مضان من عينات مختلفة.
وتم قياس كمية الشكل 4. البيانات باستخدام برامج التحليل RelQuant LightCycler. عادة، ثلاثة مكررات من عينات يتم تحليلها كمجموعة والعينات التي تنتج يتم استبعاد نتائج غير متناسقة بشكل واضح ويعني يحسب تركيزات والانحرافات المعيارية من ثلاث نسخ.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
وقد تم التعبير عن الشاذة من بعض miRNAs وجدت على الدوام في أورام البروستات بالمقارنة مع الأنسجة الطبيعية 10، والذين وردت أسماؤهم بعض هذه miRNAs كعوامل محتملة علاجية جديدة ضد سرطان البروستاتا 11. لذلك نجد أن مستويات التعبير المنحرف من miRNAs تكون مفيدة المؤشرات الحيوية التشخيصية و / أو النذير. منهجية qPCR في الوقت الحقيقي المقدمة هنا يقدم فحص دقيق لتقدير مستويات ميرنا في أنسجة ورم البروستات. لا يمكن للنظام PCR miScript تستخدم لكشف الاختلافات بين النوكليوتيدات و...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
وقد تم تمويل هذا العمل من قبل المعهد الكندي لابحاث السرطان في المجتمع، لا تمنح. 019038.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| اسم كاشف | شركة | فهرس العدد | |
| TRIzol الكاشف | إينفيتروجن | 15596 | |
| miScript كيت النسخ العكسي | QIAGEN | 218061 | |
| فحوصات التمهيدي miScript | QIAGEN | تجربة محددة | |
| miScript SYBR الأخضر PCR كيت | QIAGEN | 218073 | |
| LightCycler 3.5 نظام PCR في الوقت الحقيقي | روش | ||
| ضوء Cycler الأوعية الشعرية | روش | 04929292001 | |
| NanoDrop 1000 طيفي | الحرارية العلمية | 2538 | |
| اجيلنت 2100 Bioanalyzer | G2943CA |
المراجع
- Reinhart, B. J. MicroRNAs in plants. Genes Dev. 16, 1616-1616 (2002).
- Xu, P. The Drosophila microRNA Mir-14 suppresses cell death and is required for normal fat metabolism. Curr. Biol. 13, 790(2003).
- Bueno, M. J., Perez, deC. astro, I,, Malumbres, M. Control of cell proliferation pathways by microRNAs. Cell Cycle. 7, 3143-3143 (2008).
- Friedman, R. C. Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs. Genome Res. 19, 92(2009).
- Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116, 281-281 (2004).
- Croce, C. M. Causes and consequences of microRNA dysregulation in cancer. Nat. Rev. Genet. 10, 704(2009).
- Coppola, V., De, M. R., Bonci, D. MicroRNAs and prostate cancer. Endocr. Relat. Cancer. 17, 1-1 (2010).
- Gordanpour, A. miR-221 Is down-regulated in TMPRSS2:ERG fusion-positive prostate cancer. Anticancer Res. 31, 403-403 (2011).
- Nam, R. K. Expression of the TMPRSS2:ERG fusion gene predicts cancer recurrence after surgery for localised prostate cancer. Br. J. Cancer. 97, 1690(2007).
- Ambs, S. Genomic profiling of microRNA and messenger RNA reveals deregulated microRNA expression in prostate cancer. Cancer Res. 68, 6162(2008).
- Liu, C. The microRNA miR-34a inhibits prostate cancer stem cells and metastasis by directly repressing CD44. Nat. Med. 17, 211(2011).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
