Количественные реального времени полимеразной цепной реакции (КПЦР) представляет собой быстрый и чувствительный метод для исследования уровня экспрессии различных микроРНК (миРНК) молекул в опухолевых образцах. Используя этот метод выражения сотен различных молекул микроРНК может быть усилен, количественно и проанализированы с той же кДНК шаблона.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Обнаружение микроРНК в опухолях простаты количественного ПЦР в реальном времени (КПЦР)
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
МикроРНК (миРНК) представляют собой одноцепочечные некодирующие молекулы РНК длиной 18–24 нуклеотида. Они участвуют практически в каждом клеточном процессе, включая развитие1, апоптоз2 и регуляцию клеточного цикла3. По имеющимся оценкам, миРНК регулируют экспрессию от 30% до 90% генов человека4, связываясь со своими мишенями — матричными РНК (мРНК)5. О повсеместном нарушении регуляции миРНК сообщалось при различных заболеваниях и подтипах рака6. Благодаря своей распространенности и уникальной структуре эти малые молекулы, вероятно, станут биомаркерами, терапевтическими агентами и/или мишенями следующего поколения.
Методы, используемые для исследования экспрессии miRNA, включают количественную ПЦР (кПЦР) с применением красителя SYBR green I, а также с использованием зондов Taqman. Для эффективного применения miRNA в клинической практике крайне важно, чтобы их определение в свежих и/или архивных клинических образцах было точным, воспроизводимым и специфичным. кПЦР широко применяется для валидации экспрессии miRNA при полногеномных анализах, таких как исследования с помощью микрочипов7. В данном протоколе использовались образцы пациентов, перенесших радикальную простатэктомию по поводу клинически локализованного рака предстательной железы, однако их можно заменить другими тканями или клеточными линиями. Образцы предстательной железы после резекции подвергали мгновенной заморозке в жидком азоте. Для последующего анализа собирались клинические показатели и данные динамического наблюдения за каждым пациентом8.
Количественное определение уровней miRNA в образцах опухолей предстательной железы. Основные этапы анализа опухолей методом qPCR включают: экстракцию тотальной РНК, синтез кДНК и детекцию продуктов qPCR с использованием специфических праймеров для miRNA. Тотальная РНК, включающая мРНК, miRNA и другие малые РНК, экстрагировалась из образцов с использованием реагента TRIzol. Для синтеза кДНК и проведения qPCR использовалась система miScript от компании Qiagen (Рисунок 1). Эндогенные miRNA не полиаденилированы, поэтому в процессе обратной транскрипции поли(А)-полимераза полиаденилирует miRNA. miRNA используется в качестве матрицы для синтеза кДНК с помощью олиго-dT и обратной транскриптазы. Универсальная тег-последовательность на 5'-конце олиго-dT праймеров облегчает амплификацию кДНК на этапе ПЦР. Амплификация продукта ПЦР детектируется по уровню флуоресценции, излучаемой SYBR Green — красителем, который интеркалирует в двухцепочечную ДНК. Специфические праймеры для miRNA вместе с универсальным праймером, который связывается с универсальной тег-последовательностью, обеспечивают амплификацию специфических последовательностей miRNA.
Наборы праймеров miScript Primer Assays доступны для более чем тысячи специфичных для человека miRNA и сотен специфичных для мыши miRNA. Для количественного определения экспрессии miRNA в данной работе использовался метод относительного количественного анализа. Чтобы скорректировать вариабельность между различными образцами, уровни экспрессии целевой miRNA нормируются по уровням экспрессии референсного гена. Выбор гена для нормировки экспрессии мишеней имеет решающее значение при использовании метода относительного количественного анализа. Примерами референсных генов, обычно используемых в этих целях, являются малые РНК RNU6B, RNU44 и RNU48, так как они считаются стабильно экспрессируемыми в большинстве образцов. В данном протоколе в качестве референсного гена используется RNU6B.
Протокол
1. Простата сбора проб
- Сбор образцов простаты во время простатэктомии. Образец располагается с анатомическим ориентирам. Предстательная железа и семенные пузырьки окрашены следующим образом: правый зеленый сторону, левую сторону синего.
- Случайные поперечные средней части простаты берется перпендикулярно поверхности ректальные, замораживали в жидком азоте и хранили при -80 ° C 9.
- Накопленные кусочки образцы фотокопий, ориентированный (передний, задний, правый и левый), разделенный на четыре части. Разделы сократить помощью криостата.
- Разделы окрашивали H & E и рассмотрены патологоанатомом, чтобы определить и ра....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Аномальные проявления некоторых микроРНК были последовательно найдены в опухоли простаты по сравнению с нормальной тканью 10, и некоторые из этих микроРНК были названы как потенциальные новые терапевтические средства против рака простаты 11. Таким образом, аномальным уровнем экспрессии микроРНК может быть полезным диагностическим и / или прогностических биомаркеров. Real-Time КПЦР методологии, представленной здесь, представляет собой тест для точной количественной оценки уровней микроРНК в тканях о.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Нет конфликта интересов объявлены.
Благодарности
Эта работа финансируется Канадским онкологическое общество Научно-исследовательский институт, грант №. 019038.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Название реагента | Компания | Номер по каталогу | |
| TRIzol реагентов | Invitrogen | 15596 | |
| miScript обратной транскрипции Kit | Qiagen | 218061 | |
| miScript Анализы Primer | Qiagen | Эксперимент конкретных | |
| miScript SYBR Green PCR Kit | Qiagen | 218073 | |
| LightCycler 3,5 Real-Time PCR System | Roche | ||
| Свет Cycler Капилляры | Roche | 04929292001 | |
| NanoDrop 1000 спектрофотометр | Thermo Scientific | 2538 | |
| Agilent 2100 биоанализаторе | G2943CA |
Ссылки
- Reinhart, B. J. MicroRNAs in plants. Genes Dev. 16, 1616-1616 (2002).
- Xu, P. The Drosophila microRNA Mir-14 suppresses cell death and is required for normal fat metabolism. Curr. Biol. 13, 790(2003).
- Bueno, M. J., Perez, deC. astro, I,, Malumbres, M.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
