उत्सुकता आधारित कम आत्मीयता कोशिकी रिसेप्टर Ligand सहभागिता के स्केलेबल पता लगाने के लिए बाह्य सहभागिता स्क्रीनिंग (AVEXIS)

Summary

AVEXIS एक उच्च throughput प्रोटीन बातचीत के उपन्यास कोशिकी रिसेप्टर ligand सेलुलर मान्यता प्रक्रिया में शामिल जोड़े के लिए व्यवस्थित स्क्रीन करने के लिए विकसित परख है. यह विशेष रूप से है कि अन्य उच्च throughput दृष्टिकोण का उपयोग कर की पहचान करने के लिए मुश्किल हैं क्षणिक प्रोटीन बातचीत का पता लगाने के लिए डिज़ाइन किया गया है.

Abstract

Extracellular protein:protein interactions between secreted or membrane-tethered proteins are critical for both initiating intercellular communication and ensuring cohesion within multicellular organisms. Proteins predicted to form extracellular interactions are encoded by approximately a quarter of human genes¹, but despite their importance and abundance, the majority of these proteins have no documented binding partner. Primarily, this is due to their biochemical intractability: membrane-embedded proteins are difficult to solubilise in their native conformation and contain structurally-important posttranslational modifications. Also, the interaction affinities between receptor proteins are often characterised by extremely low interaction strengths (half-lives < 1 second) precluding their detection with many commonly-used high throughput methods².

Here, we describe an assay, AVEXIS (AVidity-based EXtracellular Interaction Screen) that overcomes these technical challenges enabling the detection of very weak protein interactions (t_1/2 ≤ 0.1 sec) with a low false positive rate³. The assay is usually implemented in a high throughput format to enable the systematic screening of many thousands of interactions in a convenient microtitre plate format (Fig. 1). It relies on the production of soluble recombinant protein libraries that contain the ectodomain fragments of cell surface receptors or secreted proteins within which to screen for interactions; therefore, this approach is suitable for type I, type II, GPI-linked cell surface receptors and secreted proteins but not for multipass membrane proteins such as ion channels or transporters.

The recombinant protein libraries are produced using a convenient and high-level mammalian expression system⁴, to ensure that important posttranslational modifications such as glycosylation and disulphide bonds are added. Expressed recombinant proteins are secreted into the medium and produced in two forms: a biotinylated bait which can be captured on a streptavidin-coated solid phase suitable for screening, and a pentamerised enzyme-tagged (β-lactamase) prey. The bait and prey proteins are presented to each other in a binary fashion to detect direct interactions between them, similar to a conventional ELISA (Fig. 1). The pentamerisation of the proteins in the prey is achieved through a peptide sequence from the cartilage oligomeric matrix protein (COMP) and increases the local concentration of the ectodomains thereby providing significant avidity gains to enable even very transient interactions to be detected. By normalising the activities of both the bait and prey to predetermined levels prior to screening, we have shown that interactions having monomeric half-lives of 0.1 sec can be detected with low false positive rates³.

Protocol

1. चारा और शिकार प्लास्मिड अभिव्यक्ति वैक्टर का एक पुस्तकालय संकलन सेल सतह रिसेप्टर और ब्याज की secreted प्रोटीन बातचीत के लिए जांच की एक सूची संकलन और एक उपयुक्त प्रोटीन अनुक्रम डेटाबेस से उनके दृश्यों को पुनः प्राप्त. स्रावी एन टर्मिनल संकेत पेप्टाइड प्रोटीन युक्त उपयुक्त हैं (इन में शामिल हैं मैं लिखें, जीपीआई से जुड़े और secreted है प्रोटीन). आमतौर पर, एक प्रोटीन परिवार (जैसे इम्मुनोग्लोबुलिन superfamily या सभी रिसेप्टर्स एरिथ्रोसाइट के रूप में इस तरह के एक विशेष सेल प्रकार के लिए प्रतिबंधित) का चयन किया जाएगा. संकेत पेप्टाइड और transmembrane क्षेत्र प्रोटीन सुविधा भविष्यवाणी सॉफ्टवेयर का उपयोग करने के स्थान की पहचान के द्वारा बाह्य क्षेत्रों की सीमा निर्धारित करें. हम आम तौर पर SignalP 5 v3.0 और TMHMM के 6 v2.0 का उपयोग करें. डिजाइन प्राइमर सेट है कि एक रिसेप्टर के लिए पूरे ectodomain टुकड़ा बढ़ाना. हम चारा और शिकार वैक्टर का एक सूट है कि इस उद्देश्य जो एक कर रहे हैं के लिए उपयुक्त हैंAddgene (से vailable http://www.addgene.org/~~V ). चना प्रतिबंध एंजाइम साइट और एक इष्टतम Kozak अनुक्रम शामिल methionine शुरू के चारों ओर भावना प्राइमर डिजाइन, इस सटीक मैच अनुक्रम जीन – विशिष्ट (2A छवि) के 25 आधार जोड़े द्वारा पीछा किया जाता है. प्रकार मैं रिसेप्टर प्रोटीन भविष्यवाणी transmembrane क्षेत्र के लिए पहले एक घुलनशील पुनः संयोजक प्रोटीन के रूप में इतनी के रूप में पूरे ectodomain व्यक्त करने के लिए छिन्ननु डिजाइन antisense प्राइमर. इस भजन की पुस्तक में एएससीआई प्रतिबंध साइट है जो फिर एक सी टर्मिनल चूहा Cd4d3 4 प्रोटीन 7 टैग (2A छवि) फ्रेम में अनुवाद होना चाहिए शामिल हैं. सभी इन प्राइमरों का उपयोग जीन से ectodomain टुकड़े बढ़ाना और उन्हें प्रलोभन या शिकार वेक्टर में क्लोन. हम कभी कभी यह करने के लिए पहले उन्हें शटल वैक्टर में क्लोन के लिए उपयोगी एक उपयुक्त स्तनधारी अभिव्यक्ति वेक्टर में subcloning से पहले, हम 3,4 pTT3 वेक्टर की एक व्युत्पन्न का उपयोग लगता है. दोनों चारा और शिकार वैक्टर contain सी टर्मिनल प्रोटीन के रूप में टैग (छवि 2B). फँसाना चाहे: (छवि 2B एक टैग युक्त 3 चूहा CD4 प्रोटीन (4 Cd4d3) एक पेप्टाइड अनुक्रम है कि ई. कोलाई बीरा एंजाइम के लिए एक सब्सट्रेट के द्वारा पीछा किया और इसलिए एक विशिष्ट lysine अवशेषों पर monobiotinylated किया जा सकता है और डोमेन 4) . Cd4d3 4 टैग OX68 मोनोक्लोनल एंटीबॉडी द्वारा मान्यता प्राप्त है और एलिसा द्वारा चारा प्रोटीन की अभिव्यक्ति मात्रा ठहराना करने के लिए इस्तेमाल किया. इस चारा प्रोटीन इसलिए monomeric और monobiotinylated हैं. अतिरिक्त प्रलोभन प्रोटीन वैक्टर जहां biotinylatable पेप्टाइड शुद्धि के लिए एक 6 – उसके टैग के द्वारा प्रतिस्थापित किया गया है उपलब्ध हैं. Preys: preys भी एक चूहा Cd4d3 4 चूहा उपास्थि oligomeric मैट्रिक्स प्रोटीन (COMP) और एक सी टर्मिनल β-lactamase एंजाइम से एक पेप्टाइड अनुक्रम के द्वारा बाद टैग होते हैं. COMP के पेप्टाइड सुनिश्चित करता है शिकार रूपों pentamers एक बार व्यक्त (छवि 2B). 2. शिकार और चारा, प्रोटीन अभिव्यक्ति हम का उपयोग करेंएक सुविधाजनक उच्च स्तर अभिव्यक्ति HEK293E सेल 4 लाइन के लिए हमारे प्रोटीन पुस्तकालयों उत्पादन के निलंबन संस्कृति, लेकिन किसी भी स्तनधारी अभिव्यक्ति प्रणाली का उपयोग कर प्रणाली उपयुक्त होना चाहिए. एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध विकल्प फ्रीस्टाइल प्रणाली है. कोशिकाओं नियमित रूप से 37 में एक मिलाते हुए प्लेटफार्म (125 आरपीएम) पर संवर्धित डिग्री सेल्सियस, 5% से 70% सापेक्ष आर्द्रता में सीओ 2. दोनों सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण प्रोटीन भी व्यक्त किया जाना चाहिए. चूहा Cd4d3 चार टुकड़ा टैग केवल दोनों चारा और शिकार के रूप में उपलब्ध है और उपयुक्त नकारात्मक नियंत्रण कर रहे हैं. इसी तरह, चारा और शिकार वैक्टर है कि एक सकारात्मक नियंत्रण सांकेतिक शब्दों में बदलना (Addgene) कर रहे हैं, हम आम तौर पर चूहे Cd200 – Cd200R 8 बातचीत का उपयोग करें. HEK293E कोशिकाओं बीज 2.5 x 10 5 कोशिकाओं के घनत्व -1 एमएल में अभिकर्मक करने के लिए पहले दिन. हम निर्माता की सिफारिशों का पालन Freestyle293 मीडिया में 50 एमएल की मात्रा में नियमित रूप से कोशिकाओं संस्कृति. कुशल biotinylation सुनिश्चित करने के लिए, टी पूरकवह सेल संस्कृति माध्यम 100 माइक्रोन की अंतिम एकाग्रता डी बायोटिन के साथ चारा प्रोटीन का उत्पादन किया. शिकार प्रोटीन व्यक्त किया मध्यम अतिरिक्त डी बायोटिन के साथ पूरक की जरूरत नहीं है. अगले दिन, transfect कोशिकाओं को एक उपयुक्त transfections अभिकर्मक का उपयोग (जैसे 293fectin). 50 एमएल संस्कृति transfect biotinylated फँसाना चाहे उत्पादन के 25 μg चारा या शिकार प्लाज्मिड constructs का प्रयोग करें, सह transfect प्लाज्मिड एन्कोडिंग चारा है कि ई. कोलाई प्रोटीन बायोटिन ligase के एक secreted रूप encodes एक प्लाज्मिड के साथ निर्माण ( ) बीरा जो Addgene से उपलब्ध है. प्लाज्मिड एन्कोडिंग secreted बीरा प्रोटीन का एक 10:1 अनुपात (2.5 μg) में सह – transfect चारा प्लास्मिड. फसल पहले 3000 एक्स जी पर centrifugation द्वारा 20 एक .22 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से सतह पर तैरनेवाला का निस्पंदन के बाद मिनट के लिए कोशिकाओं pelleting द्वारा पांच दिन के बाद अभिकर्मक, संस्कृतियों. [सुझाव: चारा और शिकार प्रोटीनडिग्री सेल्सियस 4 में undiluted और एक सामान्य दिशानिर्देश के रूप में एक वर्ष के भीतर इस्तेमाल किया जाना चाहिए संग्रहित किया जाना चाहिए. 50 μg / एमएल polymyxin बी सल्फेट या 10 मिमी NaN 3 के लिए supernatants के जीवाणु संक्रमण को रोकने के जैसे bacteriostatics जोड़ें.] 3. चारा और शिकार नमूने की Normalisation AVEXIS परख की प्रमुख विशेषताओं में से एक है कि क्योंकि पुनः संयोजक प्रोटीन secreted हैं वे या पतला किया जा सकता है ध्यान केंद्रित (सामान्यीकृत) स्थापना परख में इस्तेमाल किया जा रहा से पहले सीमा गतिविधियों के भीतर. हमने पाया है कि स्तरों पर जो पुनः संयोजक प्रोटीन व्यक्त कर रहे हैं एक विस्तृत रेंज अवधि तक 4 परिमाण के आदेश और इतना सामान्य कदम काफी स्क्रीन दौरान झूठी सकारात्मक की संख्या को कम कर देता है. 3.1 चारा सामान्य नोट: डी बायोटिन unconjugated मीडिया डायलिसिस द्वारा (आमतौर पर) से हटा दिया जाना चाहिए क्योंकि यह biotinylated बाई के साथ प्रतिस्पर्धा करेंगेटी प्रोटीन बाध्यकारी साइटों streptavidin के लिए बाध्य. डायलिसिस टयूबिंग लेबल, में चारा supernatants के स्थानांतरण, सुरक्षित क्लिप और पीबीएस के रूप में एक उपयुक्त बफर मुक्त बायोटिन हटाने के खिलाफ बड़े पैमाने पर अपोहन करना. टिप [: हमने पाया है कि पर्याप्त डायलिसिस x 6 एक 24 घंटे की अवधि 4 से अधिक परिवर्तन के साथ 50 एमएल पीबीएस के 4.5 एल के एक मात्रा के खिलाफ चारा supernatants के लिए सामान्य रूप से हासिल की है. अपर्याप्त डायलिसिस चारा सामान्य चरण के दौरान कम dilutions में बाध्यकारी प्रोटीन का एक निषेध द्वारा मनाया जा सकता है (छवि 3A.) एक एलिसा प्रदर्शन करने के लिए रिश्तेदार का स्तर जो चारा प्रोटीन व्यक्त कर रहे हैं निर्धारित. Biotinylated चारा प्रोटीन की एक कमजोर पड़ने श्रृंखला तैयार और उन्हें लेपित microtitre streptavidin थाली पर कब्जा. का पता लगाने के लिए और कब्जा कर लिया चारा (OX68) एक मोनोक्लोनल एंटीबॉडी का उपयोग प्रोटीन यों चूहा Cd4d3 4 टैग का प्रयोग करें. ध्यान लगाओ या सभी Biot को तर करने के लिए आवश्यक न्यूनतम राशि के लिए चारा प्रोटीन को कमजोरबाध्यकारी साइटों में एक streptavidin लेपित प्लेट अच्छी तरह से में. फॉस्फेट लेपित के साथ एक थाली streptavidin के कुओं ब्लॉक बफर saline/0.1% बीच (PBST) के 20/2% गोजातीय सीरम albumin (BSA) के लिए 15 मिनट. एक अलग प्लेट में, PBST / 2% BSA और streptavidin लेपित प्लेट के कुओं के लिए स्थानांतरण में प्रोटीन चारा के कमजोर पड़ने श्रृंखला (चार 01:03 dilutions के लिए पर्याप्त आम तौर पर कर रहे हैं) बनाते हैं. कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए सेते हैं. PBST में 3x धो लें. 2 μg / एमएल माउस विरोधी चूहे Cd4d3 कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए चार आईजीजी सेते हैं (OX68) के 100 μL जोड़ें. PBST में 3x धो लें. PBST / BSA 2% में 1:5,000 कमजोर पड़ने पर विरोधी माउस alkaline फॉस्फेट के 100 μL जोड़ें और कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए सेते हैं. PBST में 3x धो और किसी भी अवशिष्ट साबुन को हटाने के लिए पीबीएस में एक अंतिम धोने का प्रदर्शन करने के लिए. 1 मिलीग्राम / एमएल (10% diethanolamine (v / v), 0.5mm 2 MgCl, 10 मिमी 3 नेन, pH9.8, 4 पर प्रकाश से संग्रहीत संरक्षित diethanolamine बफर में 104 सब्सट्रेट के 100 μL जोड़ेंडिग्री सेल्सियस). के बाद एक घंटे, 405 एनएम पर उपाय absorbance के. प्रतिनिधि चारा सामान्य परिणाम चित्रा 3A में दिखाए जाते हैं. चारा है कि प्रोटीन का स्तर है कि करने के लिए एक streptavidin लेपित प्लेट सभी बायोटिन बाध्यकारी साइटों तर करने के लिए अपर्याप्त हैं पर व्यक्त कर रहे हैं, जब undiluted इस्तेमाल किया, Vivaspin concentrators (Vivascience, 10kDa MWCO) का उपयोग करते हुए ध्यान केंद्रित किया जाना चाहिए. एक गाइड के रूप में, हम का अनुमान है कि एक ठेठ चारा प्रोटीन (~ 80 केडीए) ~ 5 μg एक 96 अच्छी तरह से थाली तर करने के लिए पर्याप्त है. चारा उच्च स्तर पर व्यक्त प्रोटीन PBST / 2% BSA में एक streptavidin-लेपित प्लेट तर करने के लिए पर्याप्त एकाग्रता के लिए पतला किया जा सकता है. फँसाना चाहे का गतिविधि कमजोर पड़ने या एकाग्रता के बाद rechecked किया जाना चाहिए करने के लिए सुनिश्चित करें कि वे सभी streptavidin लेपित थाली में बायोटिन बाध्यकारी साइटों तर. 3.2 शिकार सामान्य रिश्तेदार का स्तर जो शिकार प्रोटीन व्यक्त कर रहे हैं β-lactamase का उपयोग योंगतिविधि एंजाइम. सबसे पहले शिकार प्रोटीन / PBST में 2% BSA बफर युक्त सतह पर तैरनेवाला के कमजोर पड़ने श्रृंखला बनाते हैं. तो एक 242 (0.125 मिलीग्राम / एमएल) में माइक्रोन nitrocefin समाधान (Calbiochem) के 60 μL dilutions की 20 μL जोड़ने. तुरंत एक microtitre प्लेट पाठक है कि कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए हर मिनट 485 एनएम पर एक absorbance के माप लेता प्लेट हस्तांतरण. प्रतिनिधि शिकार सामान्य परिणाम चित्रा 3B में दिखाए जाते हैं. ध्यान लगाओ केन्द्रापसारक concentrators के नमूने का उपयोग कर या उन्हें / 2 PBST% BSA में पतला ~ 2 मिनट nmol -1 nitrocefin के कारोबार की एक सीमा गतिविधि तक पहुँचने. व्यावहारिक रूप से, अगर यह सब nitrocefin ~ 7 मिनट के भीतर hydrolysed है हासिल की है. 4. AVEXIS स्क्रीनिंग प्रक्रिया PBST में एक streptavidin लेपित प्लेट धो लें. एक अच्छी तरह से 100/2 PBST% BSA के μL जोड़ें और 30 मिनट के लिए एक अच्छी तरह के भीतर किसी भी नकली प्रोटीन बाध्यकारी साइटों को ब्लॉक के लिए सेते हैं. </li> [सुझाव: करने के लिए धोने के कदम के बाद किसी भी अवशिष्ट धो बफर निकालने के लिए, थाली टेप है – सख्ती से कागज तौलिए पर] एक सिंक पर थाली के एक स्मार्ट झाड़ू के साथ अवरुद्ध समाधान निकालें और 100 μL सामान्यीकृत biotinylated monomeric चारा उपयुक्त कुओं को जोड़ने के लिए और कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए सेते हैं. थाली से चारा नमूने थाली upturning और चालाकी से एक सिंक से अधिक से flicking द्वारा, निकालें और PBST में 3 बार धो लो. सामान्यीकृत pentamerized शिकार की 100 μL एक अच्छी तरह से निर्माण और 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं, के रूप में 4.4 चरण में धोने और एक के पीबीएस साथ अंतिम धोने केवल प्रदर्शन जोड़ें. 242 माइक्रोन nitrocefin, समाधान (DMSO की 500 μL में 5 मिलीग्राम nitrocefin की भंग, अच्छी तरह से और फिर मिश्रण और 40 एमएल पीबीएस में nitrocefin पतला और प्लेटों को जोड़ने से पहले एक .22 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से गुजारें) के 60 μL जोड़ें और कमरे के तापमान पर सेते हैं . सकारात्मक बातचीत मनाया जा सकता हैके बाद से आँख से एक लाल रंग के लिए पीले nitrocefin hydrolysed है. 485 एनएम पर एक प्लेट रीडर का उपयोग absorbance के पढ़ने के द्वारा यों. एक ठेठ प्लेट और quantitation छवि में दिखाया गया है. 4. [सुझाव: सकारात्मक बातचीत आम तौर पर कमरे के तापमान पर 2 घंटे के भीतर मनाया हालांकि प्लेटें डिग्री सेल्सियस 4 में 16 घंटे के लिए रखा जाना चाहिए करने के लिए सुनिश्चित करें के लिए सभी संभावित बातचीत से पता चला रहे हैं. हम यह भी पाया है कि उपजी और खरोंच / उँगलियों के निशान के रूप में microtitre थाली की प्लास्टिक पर nitrocefin खामियों कभी कभी नहीं प्रकट nitrocefin के hydrolysis के बावजूद 485 एनएम artefactual झूठी सकारात्मक के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. इसलिए यह उचित प्लेटों की तस्वीरें लेने के लिए नेत्रहीन कुओं में nitrocefin कारोबार का रिकॉर्ड है.] 5. प्रतिनिधि परिणाम एक प्रतिनिधि AVEXIS स्क्रीनिंग थाली का एक उदाहरण 4 चित्र में दिखाया गया है. एक में nitrocefin सब्सट्रेट की hydrolysis (लाल पीला) का पालन करना चाहिएके बारे में दस मिनट के भीतर सकारात्मक नियंत्रण कुओं (दोनों शिकार एंटीबॉडी की मध्यस्थता कब्जा है और यह भी सकारात्मक नियंत्रण बातचीत के नियंत्रण). स्क्रीन के भीतर कुछ बातचीत भी इस समय के पैमाने में मनाया जाता है, लेकिन दूसरों को लंबे समय तक ले सकता है (कुछ घंटे) प्रकट करने के लिए. आमतौर पर, दर 0.4-0.6% के आसपास (हर 150-250 बातचीत की जांच की जा रहा है के लिए एक सकारात्मक बातचीत) के हिट ठेठ है, प्रोटीन जा रहा है जांच पुस्तकालयों पर निर्भर करता है. आकृति 1. रिसेप्टर ligand सेलुलर मान्यता प्रक्रियाओं मध्यस्थता AVEXIS का उपयोग कर बातचीत की पहचान. योजनाबद्ध दो बातचीत (ए और बी) कोशिकाओं झिल्ली एम्बेडेड रिसेप्टर प्रोटीन के बीच बातचीत के माध्यम से जानकारी का आदान प्रदान से पता चलता है. AVEXIS एक स्केलेबल प्रोटीन बातचीत परख विशेष रूप से उपन्यास रिसेप्टर ligand जोड़े जो बहुत कमजोर बातचीत ताकत की विशेषता है की पहचान करने के लिए बनाया है. ताकि पुनः संयोजकमें प्रोटीन luble दोनों कोशिकाओं के सेल सतह रिसेप्टर प्रदर्शनों की सूची के पूरे ectodomain प्रतिनिधित्व पुस्तकालयों या तो β-lactamase टैग pentameric preys के रूप में संकलित कर रहे हैं (सेल एक प्रकार) या monomeric बायोटिन टैग फँसाना चाहे (सेल प्रकार बी के लिए). preys की pentamerisation ectodomains एक समग्र उत्सुकता लाभ प्रभाव इतना है कि बहुत क्षणिक बातचीत भी पता लगाया जा सकता है की स्थानीय एकाग्रता बढ़ जाती है. चारा पुस्तकालय streptavidin-लेपित प्लेट पर arrayed है और व्यवस्थित शिकार प्रोटीन के साथ बातचीत के लिए जांच की. एक संक्षिप्त धोने के बाद, किसी भी कब्जा कर लिया preys β-lactamase शिकार के साथ जुड़े गतिविधि का उपयोग कर रहे हैं पता है. चित्रा 2. चारा और शिकार का निर्माण डिजाइन. (ए) चूहा Cd200 रिसेप्टर प्रोटीन कैसे सेल सतह रिसेप्टर प्रोटीन की पूरी ectodomains निर्धारित कर रहे हैं और प्राइमरों दोनों चारा तैयार कर रहे हैं का एक उदाहरण के रूप में प्रदान की जाती हैशिकार और अभिव्यक्ति constructs. सीडीएनए और प्रोटीन अनुक्रम संकेत एन टर्मिनल पेप्टाइड से झिल्ली फैले Cd200 चूहे की transmembrane क्षेत्र के लिए दिखाए जाते हैं. भावना प्राइमर 5 'चना प्रतिबंध एंजाइम साइट और इष्टतम Kozak अनुक्रम Cd200 सीडीएनए अनुक्रम 25 सटीक मैच अनुक्रम के ठिकानों के बाद शामिल करने के लिए डिज़ाइन किया गया है. antisense प्राइमर एक एएससीआई साइट और सटीक मिलान तुरंत चयनित ectodomain truncation अवशेषों की नदी के ऊपर स्थित अनुक्रम के 25 ठिकानों शामिल हैं. को चूहा Cd4d3 4 टैग के साथ फ्रेम में ectodomain रखने, एएससीआई साइट Gly – आला – प्रो के रूप में अनुवाद होना चाहिए. (बी) चारा और शिकार अभिव्यक्ति constructs की योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व. प्रत्येक रिसेप्टर चना और एएससीआई साइटों और एक Cd4d3 4 टैग द्वारा चारों ectodomains शामिल हैं. फँसाना चाहे एक पेप्टाइड सी टर्मिनल अनुक्रम है कि विशेष रूप से एक प्लाज्मिड secreted बीरा एंजाइम व्यक्त के साथ किया जा सकता है cotransfection द्वारा monobiotinylated होते हैं. preys pentamerisation अनुक्रम के बाद कर रहे हैंउपास्थि oligomeric मैट्रिक्स प्रोटीन (COMP) और β-lactamase एंजाइम से. चित्रा 3. चारा और शिकार प्रोटीन की Normalisation (ए) चारा सामान्य के प्रतिनिधि उदाहरण. चार अलग अलग dialysed चारा supernatants की एक कमजोर पड़ने श्रृंखला एलिसा द्वारा पाया गया टैग विरोधी CD4 मोनोक्लोनल एंटीबॉडी का उपयोग. चार फँसाना चाहे विभिन्न 1 2>> 3 4> स्तर पर व्यक्त कर रहे हैं. फँसाना चाहे एक दहलीज स्तर है कि हर अच्छी तरह से बाध्यकारी साइटों में बायोटिन संतृप्त करने के लिए सामान्यीकृत किया जाना चाहिए. उच्च व्यक्त फँसाना चाहे करने के लिए प्रोटीन के संरक्षण के लिए पतला किया जा सकता है (जैसे एक चारा 1:100 ~ पतला किया जा सकता है), और खराब व्यक्त फँसाना चाहे केंद्रित. कम dilutions पर कम रीडिंग कभी कभी कुछ (जैसे 2 चारा) फँसाना चाहे जो अधूरा डायलिसिस के कारण unconjugated डी बायोटिन की उपस्थिति के कारण है में मनाया जाता है. (बी) के स्तर पर जो प्रोटीन शिकार पूर्व कर रहे हैंदबाया एक सब्सट्रेट β lactamase, nitrocefin, hydrolysis के दर का उपयोग मात्रा है. दिखाए गए उदाहरण में, तीन preys विभिन्न स्तरों पर व्यक्त कर रहे हैं: 1 शिकार> 2> 3. Preys ~ 2 nmol मिनट -1, जो ~ 7 मिनट में 14.5 nmol nitrocefin की hydrolysis के पूरा (जैसे शिकार 1) मेल खाती है एक गतिविधि के लिए सामान्यीकृत किया जाना चाहिए. इस उदाहरण में अन्य preys स्क्रीनिंग में उपयोग करने से पहले ध्यान केंद्रित किया जाना चाहिए. चित्रा 4. प्रतिनिधि AVEXIS स्क्रीनिंग का परिणाम है. (ए) एक प्रतिनिधि AVEXIS स्क्रीनिंग थाली की एक तस्वीर. एक शिकार प्रोटीन 41 अलग फँसाना चाहे के खिलाफ जांच की है और एक सकारात्मक बातचीत अच्छी तरह से E2 में पता चला है. स्क्रीनिंग प्लेटों में इस्तेमाल किया नियंत्रण में शामिल हैं: एक biotinylated विरोधी CD4 के लिए सभी शिकार प्रोटीन पर कब्जा एंटीबॉडी (G6) अच्छी तरह से, एक नियंत्रण बातचीत करने के लिए जोड़ी गई: चूहा Cd200 (चारा) Cd200R साथ Cd200R (शिकार) सीमा कमजोर पड़ने पर इस्तेमाल किया शिकार (एच3), (H4) 01:10 और 1:100 (H5). नकारात्मक नियंत्रण: एक Cd4d3 4 चारा शिकार प्रोटीन की जांच की जा रही (एच 1) के साथ जांच और Cd200R शिकार (H2). (बी) एक ही तीन प्रतियों में प्रदर्शन स्क्रीन के absorbance के मूल्यों की मात्रा. डेटा बिंदुओं ± मतलब एसडी हैं.

Discussion

जब जीवित कोशिकाओं vivo में मनाया जाता है, उनकी प्लाज्मा झिल्ली अत्यधिक गतिशील व्यवहार एक्ज़िबिट: विस्तार और retracting झिल्ली प्रक्रियाओं के रूप में वे संपर्क और अपने पड़ोसियों के ² के साथ संवाद. झिल्ली एम्बेडेड रिसेप्टर प्रोटीन के बीच शारीरिक बातचीत जो इन संपर्कों के कई मध्यस्थता के अत्यंत इतना कमजोर के रूप में यह अत्यधिक गतिशील व्यवहार करने की अनुमति विकसित किया है. यह अनुमान लगाया गया है कि 50 माइक्रोन के रूप में कमजोर के रूप में monomeric बातचीत ताकत शारीरिक रिसेप्टर ⁹ घनत्व जो उपन्यास अत्यंत से ^2,10 चुनौतीपूर्ण बातचीत का पता लगाने के बनाता है पर सहज बातचीत को ड्राइव करने के लिए पर्याप्त हो सकता है. बातचीत प्रोटीन है कि एक कम झूठी सकारात्मक दर के साथ एक स्केलेबल ढंग से लागू किया जा सकता है: AVEXIS विधि यहाँ वर्णित के क्षणिक कोशिकी प्रोटीन का पता लगाने के लिए एक संवेदनशील तरीका प्रदान करता है. जबकि अन्य स्केलेबल तरीकों कोशिकी बातचीत ^{11-15 का} पता लगाने के लिए विकसित किया गया है,AVEXIS का एक लाभ यह है कि चारा और शिकार की गतिविधियों के रूप में प्रयोगात्मक मापदंडों के लिए भी बातचीत की सबसे कमजोर (टी _1/2 ≤ 0.1 है) का पता लगाने, जबकि एक कम झूठी सकारात्मक ³ दर को बनाए रखना मात्रा निर्धारित किया गया है. इसके अलावा, सुव्यवस्थित और मजबूत नमूना तैयार करने की प्रक्रिया इस परख सक्षम है अन्य assays की तुलना में एक बहुत बड़े पैमाने पर लागू किया जाना है और हम हाल ही में एक व्यवस्थित बातचीत ~ 16,500 संभावित ¹⁶ बातचीत में कुल स्क्रीन का वर्णन किया है.

परख के लिए यह एक घुलनशील पुनः संयोजक प्रोटीन टुकड़ा व्यक्त करने के लिए संभव है किसी भी प्रोटीन पर किया जा सकता है. यह इसलिए कि एक एन टर्मिनल के रूप में मैं, प्रोटीन जीपीआई से जुड़े और स्रावित प्रकार संकेत पेप्टाइड शामिल प्रोटीन भी शामिल है. हमने हाल ही में वैक्टर का एक सूट है कि अब हमें फँसाना चाहे के रूप में ¹⁷ प्रकार द्वितीय प्रोटीन व्यक्त करने के लिए सक्षम बनाया है. परख आम तौर पर multipass ऐसे आयन ट्रांसपोर्टर के रूप में झिल्ली प्रोटीन के लिए उपयुक्त नहीं हैया पंपों के बाद से वे सही ढंग से एक प्लाज्मा झिल्ली के संदर्भ के बाहर तह किया जा उम्मीद नहीं कर रहे हैं. हम विभिन्न प्रणालियों की एक किस्म के लिए आवेदन किया है और सफलतापूर्वक व्यक्त zebrafish ^3,16,18, मानव, माउस और पी. प्रोटीन से कोशिकी बातचीत स्क्रीन के लिए फाल्सीपेरम.

एक AVEXIS स्क्रीन स्थापित करने के लिए आवश्यक संसाधनों के मामले में, हमने पाया है कि एक महत्वपूर्ण टोंटी चयन, निर्माण, और अभिव्यक्ति plasmids के अनुक्रमण पूर्ण है. विधि का यह पहलू एक साल के लिए लेने के लिए ~ 100 चारा और शिकार constructs कर सकते हैं, तथापि, जीन संश्लेषण की कम लागत के साथ, हम अब वाणिज्यिक पक्ष परियोजना के इस पहलू के आउटसोर्सिंग. एक बड़े मिलाते हुए टिशू कल्चर इनक्यूबेटर (हम एक INFORS एचटी Multitron सेल का उपयोग करें) के साथ स्तनधारी अभिव्यक्ति एक साथ प्रणाली एक एकल व्यक्त करने के लिए और 100 ~ चारा और शिकार प्रोटीन एक महीने के लिए मानक के अनुसार अनुसंधानकर्ता सक्षम बनाता है. एक बार प्रोटीन का उत्पादन कर रहे हैं और सामान्य, एसबातचीत के लिए creening बारह 96 अच्छी तरह से किया जा रहा है आसानी से प्रति दिन संसाधित प्लेट के साथ तेजी से है. केवल bespoke उपकरण है कि हम करने के लिए प्रोटीन की इतनी बड़ी संख्या के उत्पादन की सुविधा के लिए विकसित किया है एक संपीड़ित हवा चालित पिस्टन जो पांच supernatants समानांतर में एक 0.22μm फिल्टर के माध्यम से पारित करने के लिए प्रयोग किया जाता है.

जब साहित्य (झूठी नकारात्मक) से उम्मीद बातचीत की तुलना में याद किया जा सकता है कि बातचीत का मुख्य वर्ग homophilic बातचीत कर रहे हैं, हालांकि इन संबंधों के कुछ ³ से पता लगाया जा सकता है. मामलों में जहां बातचीत की उम्मीद नहीं कर रहे हैं पता है, हम मानते हैं कि इस शिकार प्रोटीन (एक शिकार "मास्किंग" प्रभाव) के द्वारा homophilic बातचीत जो तो स्थिर चारा प्रोटीन के साथ आगे बातचीत रोकता के गठन के कारण है. आवृत्ति, जिस पर बातचीत कर रहे हैं पता जांच पुस्तकालय जा रहा है प्रोटीन की सामग्री पर निर्भर करता है. पाठक के लिए एक गाइड,> 30 की स्क्रीन के रूप मेंहै, zebrafish इम्मुनोग्लोबुलिन superfamily भीतर 000 बातचीत 188 सकारात्मक में हुई 0.6 ^3,16,18% की एक आवृत्ति. एक बहुत तेजी से जाँच लें कि किसी भी सकारात्मक हिट की पुष्टि के लिए किया जा सकता है निर्धारित करने के लिए कि क्या बातचीत दोनों चारा शिकार झुकाव में पता लगाया जा सकता है, कि, एक ही बातचीत किया जा सकता है कि क्या बंधनकारी प्रोटीन मौजूद हैं चाहे या तो एक प्रलोभन के रूप में पता लगाया या एक शिकार है. जब भी हम इस अदल – बदल करना व्यवहार मनाया, बाध्यकारी बाद में सतह plasmon अनुनाद का उपयोग शुट्ठ प्रोटीन की प्रत्यक्ष saturable बाध्यकारी प्रदर्शन विशिष्ट होना दिखाया गया है. बात पर जोर दिया कि क्योंकि हम कृत्रिम शिकार प्रोटीन pentamerising के बंधन उत्सुकता बढ़ाने हम मात्रात्मक बातचीत की ताकत की तुलना के लिए उपयुक्त परख पर विचार नहीं करते. बातचीत हम monomeric प्रोटीन और सतह plasmon अनुनाद उपयोग की biophysical बाध्यकारी पैरामीटर प्राप्त करने के लिए. अंत में, एक बार एक बातचीत की पहचान की गई है, हायपरख की gh throughput के स्वभाव यह अपेक्षाकृत आसान परख एंटीबॉडी या छोटे अणुओं है कि बातचीत के ब्लॉक के रूप में अभिकर्मकों के लिए स्क्रीन के लिए अनुकूल बनाता है.

Materials

Name of reagent	Company	Cat. Number	Comments
Freestyle media	Invitrogen	12338018
Nitrocefin	Calbiochem	484400
SA-coated microtitre plates	Nunc	734-1284
OX68 antibody	AbDSerotec	MCA1022R
Dialysis tubing	Pierce	PN68100
Polymyxin B	Sigma	P4932
D-biotin	Sigma	B4639-5G
Substrate-104	Sigma	1040-506
Vivaspin-20 centrifugal concentrators	Sartorius	VS2002
0.22 μm filters	Nalgene	190-2520