Het analyseren van cellulaire internalisatie van nanodeeltjes en bacteriën door Multi-spectrale Imaging flowcytometrie
Summary
In dit artikel beschrijven we een methode gebruik te maken van multi-spectraal imaging flowcytometrie om de internalisering van polyanhydride nanodeeltjes of bacteriën door RAW 264.7 cellen te kwantificeren.
Abstract
Nanodeeltjes systemen naar voren zijn gekomen als waardevolle instrumenten in de toediening van vaccins door hun vermogen om efficiënt te leveren goederen, waaronder eiwitten, aan antigeen presenterende cellen 1-5. Internalizatie van nanodeeltjes (NP) door antigeen-presenterende cellen een belangrijke stap in het genereren van een effectieve immuunrespons de ingekapselde antigeen. Om hoe veranderingen in nanopartikelformulering invloed functie te bepalen, hebben we getracht een high throughput, kwantitatieve experimentele protocol dat in overeenstemming was met het opsporen van geïnternaliseerde nanodeeltjes evenals bacteriën te ontwikkelen. Tot op heden zijn twee onafhankelijke technieken, microscopie en flowcytometrie, zijn de methoden die worden gebruikt om de fagocytose van nanodeeltjes te bestuderen. De high throughput aard van flowcytometrie genereert robuuste statistische gegevens. Echter, als gevolg van lage resolutie, is niet nauwkeurig te kwantificeren geïnternaliseerd versus cel gebonden nanodeeltjes. Microscopie genereert beelden met een hoge ruimtelijke resolutie, hHof toevoegde, het is tijdrovend en het gaat om kleine steekproeven 6-8. Multi-spectrale beeldvorming flowcytometrie (MIFC) is een nieuwe technologie die aspecten van zowel microscopie en flowcytometrie dat multi-color spectrale fluorescentie en helder field imaging voert tegelijkertijd door middel van een laminaire kern opgenomen. Deze mogelijkheid biedt een nauwkeurige analyse van fluorescent signaal intensiteiten en ruimtelijke relaties tussen verschillende structuren en cellulaire functies op hoge snelheid.
Hierin beschrijven we een methode gebruik te maken van MIFC om de celpopulaties die zijn geïnternaliseerd polyanhydride nanodeeltjes of Salmonella enterica serovar Typhimurium karakteriseren. We beschrijven ook de voorbereiding van nanodeeltjes suspensies, cel-etikettering, de verwerving van een ImageStream X-systeem en de analyse van de gegevens met behulp van het IDEAS-toepassing. Ook tonen de toepassing van een techniek die kan worden gebruikt om de internalisatie p onderscheidenathways voor nanodeeltjes en bacteriën door het gebruik cytochalasine-D als een remmer van actine-gemedieerde fagocytose.
Protocol
Discussion
Onderzoek heeft aangetoond dat biologisch afbreekbare nanodeeltjes gebaseerd op poly (melkzuur-co-glycolzuur (PLGA) of polyanhydriden kan worden ingekapselde antigenen of geneesmiddelen leveren doelcellen. Opname van deze nanodeeltjes van fagocyten belangrijk voor de effectiviteit, waardoor kwantitatieve . analyse van de internalisatie van cruciaal belang in het ontwerpen van nieuwe nanodeeltjes systemen Door gebruik te maken van deze methode kan differentiële opname van nanodeeltjes door verschillende celtypen worden …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen graag de ONR-MURI Award (NN00014-06-1-1176) en het Amerikaanse leger Medical Research en Materieel Command (Grant Numeri W81XWH-09-1 tot 0386 en W81XWH-10-1-0806) bedanken voor de financiële ondersteunen.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| RAW 264.7 cell line | American Type Culture Collection (ATCC) | TIB-71 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Cellgro | 10-013-CV | |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S 11150 | Premium Grade |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| 24-well plate | TPP | 92024 | |
| Cell culture Flasks | TPP | 90151 | |
| Cell scraper | TPP | 99002 | 24 cm |
| Salmonella entericaserovar Typhimurium | ATCC | 14028 | |
| BTX ECM630 Electro Cell Manipulator | BTX Harvard Apparatus | ||
| MOPS | Fisher Scientific | BP308 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Cellgro | 21-040-CV | |
| Ultrasonic liquid processor | Misonix | S-4000 | |
| Cytochalasin-D | Sigma-Aldrich, | C8273 | |
| Formaldehyde | Polysciences | 04018 | |
| Wash buffer | 2% heat inactivated FBS, 0.1% sodium azide in PBS. | ||
| Perm/wash buffer | BD Biosciences | 554714 | |
| Clear-view snap cap microtubes | Sigma | T4816 | |
| Alexa Fluor phalloidin 660 | Invitrogen | A22285 | |
| ImageStreamX | Amnis Corporation | 100200 | Options: 658nm laser, autosampler |
| Sodium azide | Fisher Scientific | S 227I-500 |
References
- Ulery, B. D., Kumar, D., Ramer-Tait, A. E., Metzger, D. W., Wannemuehler, M. J., Narasimhan, B. Design of a protective single-dose intranasal nanoparticle-based vaccine platform for respiratory infectious diseases. PLoS One. 6, e17642 (2011).
- Kasturi, S. P., Skountzou, I., Albrecht, R. A., Koutsonanos, D., Hua, T., Nakaya, H. I., Ravindran, R., Stewart, S., Alam, M., Kwissa, M., Villinger, F., Murthy, N., Steel, J., Jacob, J., Hogan, R. J., García-Sastre, A., Compans, R., Pulendran, B. Programming the magnitude and persistence of antibody responses with innate immunity. Nature. 470, 543-547 (2011).
- Rice-Ficht, A. C., Arenas-Gamboa, A. M., Kahl-McDonagh, M. M., Ficht, T. A. Polymeric particles in vaccine delivery. Curr. Opin. Microbiol. 13, 106-112 (2010).
- Jain, J. P., Chitkara, D., Kumar, N. Polyanhydrides as localized drug delivery carrier: an update. Expert. Opin. Drug. Deliv. 5, 889-907 (2008).
- Pfeifer, B. A., Burdick, J. A., Little, S. R., Langer, R. Poly(ester-anhydride):poly(beta-amino ester) micro- and nanospheres: DNA encapsulation and cellular transfection. Int. J. Pharm. 304, 210-219 (2005).
- Ahmed, F., Friend, S., George, T. C., Barteneva, N., Lieberman, J. Numbers matter: quantitative and dynamic analysis of the formation of an immunological synapse using imaging flow cytometry. J. Immunol. Methods. 347, 79-86 (2009).
- Hampton, M. B., Winterbourn, C. C. Methods for quantifying phagocytosis and bacterial killing by human neutrophils. J. Immunol. Methods. 232, 15-22 (1999).
- Rieger, A. M., Hall, B. E., Barreda, D. R. Macrophage activation differentially modulates particle binding, phagocytosis and downstream antimicrobial mechanisms. Dev. Comp. Immunol. 34, 1144-1159 (2010).
- Murphy, K. C., Campellone, K. G. Lambda Red-mediated recombinogenic engineering of enterohemorrhagic and enteropathogenic E. coli. BMC. Mol. Biol. 4, 11 (2003).
- Karsi, A., Lawrence, M. L. Broad host range fluorescence and bioluminescence expression vectors for Gram-negative bacteria. Plasmid. 57, 286-295 (2007).
- Ulery, B. D., Phanse, Y., Sinha, A., Wannemuehler, M. J., Narasimhan, B., Bellaire, B. H. Polymer chemistry influences monocytic uptake of polyanhydride nanospheres. Pharm. Res. 26, 683-690 (2009).
- Doherty, G. J., McMahon, H. T. Mechanisms of endocytosis. Annu. Rev. Biochem. 78, 857-902 (2009).
- Vercauteren, D., Vandenbroucke, R. E., Jones, A. T., Rejman, J., Demeester, J., De Smedt, S. C., Sanders, N. N., Braeckmans, K. The use of inhibitors to study endocytic pathways of gene carriers: optimization and pitfalls. Mol. Ther. 18, 561-569 (2010).
- Di Marzio, L., Marianecci, C., Cinque, B., Nazzarri, M., Cimini, A. M., Cristiano, L., Cifone, M. G., Alhaique, F., Carafa, M. pH-sensitive non-phospholipid vesicle and macrophage-like cells: binding, uptake and endocytotic pathway. Biochim. Biophys. Acta. 1778, 2749-2756 (2008).
- Torres, M. P., Vogel, B. M., Narasimhan, B., Mallapragada, S. K. Synthesis and characterization of novel polyanhydrides with tailored erosion mechanisms. J. Biomed. Mater. Res. A. 76, 102-110 (2006).
