Polyvinyl शराब स्पंज मॉडल आरोपण

Summary

दवाओं, वृद्धि कारक है, और / या घाव की मरम्मत का एक पशु मॉडल में हेरफेर कोशिकाओं के प्रभाव का विश्लेषण करने के लिए एक उपयोगी उपकरण में वर्णित है. इस तकनीक polyvinyl शराब (PVA) स्पंज की संपत्ति का इस्तेमाल करने के लिए वांछित उपचार देने और होते हैं और यह भी एक मंच प्रदान excised और विश्लेषण.

Abstract

Wound healing is a complicated, multistep process involving many cell types, growth factors and compounds^1-3. Because of this complexity, wound healing studies are most comprehensive when carried out in vivo. There are many in vivo models available to study acute wound healing, including incisional, excisional, dead space, and burns. Dead space models are artificial, porous implants which are used to study tissue formation and the effects of substances on the wound. Some of the commonly used dead space models include polyvinyl alcohol (PVA) sponges, steel wire mesh cylinders, expanded polytetrafluoroethylene (ePTFE) material, and the Cellstick^1,2.

Each dead space model has its own limitations based on its material’s composition and implantation methods. The steel wire mesh cylinder model has a lag phase of infiltration after implantation and requires a long amount of time before granulation tissue formation begins¹. Later stages of wound healing are best analyzed using the ePTFE model^1,4. The Cellstick is a cellulose sponge inside a silicon tube model which is typically used for studying human surgery wounds and wound fluid². The PVA sponge is limited to acute studies because with time it begins to provoke a foreign body response which causes a giant cell reaction in the animal⁵. Unlike other materials, PVA sponges are easy to insert and remove, made of inert and non-biodegradable materials and yet are soft enough to be sectioned for histological analysis^2,5.

In wound healing the PVA sponge is very useful for analyzing granulation tissue formation, collagen deposition, wound fluid composition, and the effects of substances on the healing process^1,2,5. In addition to its use in studying a wide array of attributes of wound healing, the PVA sponge has also been used in many other types of studies. It has been utilized to investigate tumor angiogenesis, drug delivery and stem cell survival and engraftment^1,2,6,7. With its great alterability, prior extensive use, and reproducible results, the PVA sponge is an ideal model for many studies^1,2.

Here, we will describe the preparation, implantation and retrieval of PVA sponge disks (Figure 1) in a mouse model of wound healing.

Protocol

1. स्पंज तैयारी 0.9% (w / v) जलीय सोडियम क्लोराइड समाधान में रात भर सरगर्मी से हाइड्रेट स्पंज. उन्हें वाष्पदावी विसंक्रण द्वारा हाइड्रेटेड स्पंज जीवाणुरहित. 121 में 75 एमएल, 25 मिनट के लिए आटोक्लेव डिग्री सेल्सियस के लिए नोट: एक इलाज के रूप में नीचे वर्णित के साथ लोड हो रहा है स्पंज वैकल्पिक है. बाँझ उपकरणों के साथ एक बाँझ हुड में एक चिमटी का उपयोग कर समाधान से एक स्पंज लेने. चिमटी के साथ स्पंज निचोड़ और एक वैक्यूम टिप का उपयोग करने के लिए संभव के रूप में स्पंज से ज्यादा समाधान के रूप में निकालते हैं. एक ऊतक संस्कृति डिश में स्पंज बाहर wrung प्लेस, स्पंज के बीच जगह छोड़ने के लिए सावधान किया जा रहा है. एकाधिक अच्छी तरह प्लेटें अलग अलग उपचार के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. एक स्पंज के केन्द्र पर सीधे उपचार समाधान विंदुक. नीचे धीरे स्पंज पर विंदुक टिप के बाद समाधान स्पंज पर रखा गया है के साथ प्रेस, इस स्पंज समाधान को अवशोषित में मदद करता है. नोट: 6mm2.75 मिमी मोटी स्पंज है कि हम रोजगार के द्वारा व्यास 25 μL की एक अधिकतम पकड़ के लिए कर रहे हैं. एक बार सभी स्पंज लोड कर रहे हैं, वे थाली में हैं बर्फ पर संग्रहीत किया जा सकता है जब तक वे चूहे में प्रत्यारोपित कर रहे हैं. 2. शल्य चिकित्सा की प्रक्रिया उचित पशु असंवेदनता उत्पन्न करना और अग्रकय एनाल्जेसिक प्रशासन. पशु प्रति पूरी प्रक्रिया में लगभग 20 मिनट तक चलेगा. 30 ग्राम माउस के साथ ऑक्सीजन की प्रति मिनट 1.5 लीटर के लिए 1.5 Isoflurane% करने के लिए प्रेरित और संज्ञाहरण बनाए रखने के लिए प्रयोग किया जाता है. जब जानवर कोई अब चुटकी प्रतिवर्त परीक्षण, ढालुआं स्थिति में नाक शंकु में जगह के लिए उत्तरदायी है. एक इलेक्ट्रिक शेवर का प्रयोग एक 1 दाढ़ी अंदर कम रिब पिंजरे के नीचे उदर पक्ष पर क्षेत्र के अंदर 1. कट बालों की साफ साफ कर लें. 70% शराब के बाद betadine साथ सफाई के मुंडा क्षेत्र जीवाणुरहित. इस सफाई betadine शराब तीन बार दोहराएँ. जबकि त्वचा पकड़े सिखाया, स्केलपेल का उपयोग करने के लिए एक ऊर्ध्वाधर चीरा 1.5-2 व्यास बारस्पंज की मीटर डाला जा करने के लिए सतर्क किया जा रहा शरीर गुहा के माध्यम से कटौती नहीं है. एक चिमटी का प्रयोग करें त्वचा के किनारे पकड़ और धीरे धीरे पेशी से Metzembaum कैंची का उपयोग कर चीरा के दोनों पक्षों पर त्वचा अलग शुरू. जेब माउस की चौड़ाई में और रिब पिंजरे से पिछले पैरों के लिए जाना चाहिए. एक चिमटी का उपयोग करने के लिए पहली पक्षों से बन्द रखो द्वारा पशु में रखा जा स्पंज लेने. स्पंज स्थानांतरण सीधे चिमटी इतना है कि यह ऊपर और नीचे से आयोजित किया जाता है. चिमटी का उपयोग करने के लिए त्वचा के किनारे पकड़ और यह इतना लिफ्ट कि स्पंज डाला जा सकता है. धीरे धीरे स्पंज या नीचे के रूप में स्पंज मुश्किल को स्थानांतरित करने के लिए एक बार यह ऊतक को छुआ है मांसपेशियों और त्वचा को छू से बचने की कोशिश कर सम्मिलित. सभी स्पंज के लिए दोहराएँ. एक बार सभी स्पंज डाला गया है, जगह दो या तीन sutures के चीरा बंद करें. चिमटी की एक जोड़ी का प्रयोग चीरा के दोनों पक्षों को एक साथ पकड़ और sutu धागात्वचा के दोनों परतों के माध्यम से कर रहे हैं. पहले सिर्फ त्वचा किनारों को बंद करने के लिए पर्याप्त फेंक कस. एक से दूसरी दिशा, इस गाँठ तंग खींच समय से फेंक वर्ग गाँठ के साथ समाप्त. तो सीवन (चित्रा 2) समाप्त करने के लिए दो वर्ग समुद्री मील टाई. अतिरिक्त sutures के पूरे चीरा को बंद रखें. अन्य घाव संबंध तरीकों dermabond, घाव क्लिप, या स्टेपल के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. पशु – संज्ञाहरण प्रणाली से निकालें और निगरानी करते हुए चेतना फिर से शुरू है. पशु जल्दी ambulating शुरू करना चाहिए और पूर्व सेशन गतिशीलता के लिए लौटने. विश्वास दिलाता हूं कि वे करने के लिए पर्याप्त भोजन और पानी तक पहुँचने में सक्षम हैं. कुछ सिक्त भोजन वसूली में सहायता करने के लिए पिंजरे के तल में रखा जा सकता है. जानवर संकट या असुविधा के संकेत के लिए दैनिक की निगरानी के लिए जारी रखें, और संक्रमण, सूजन, और के लिए स्फुटन चीरा साइट की जाँच करें. उचित कार्रवाई ले लो अगर वसूली के लिए किसी भी जटिलताओं में पाए जाते हैं. 3. वैकल्पिक इंजेक्शन <p cलड़की = "jove_content" नोट: एक बार स्पंज पशु में प्रत्यारोपित किया गया है कि वे कोशिकाओं, दवाओं, वृद्धि आदि कारकों की एक समाधान के साथ अंतःक्षिप्त किया जा सकता है यह विभिन्न प्रसव के समय और प्रशासन के दौरान इंजेक्शन पदार्थ के प्रभाव के विश्लेषण के लिए अनुमति देता है शासनों. यदि इंजेक्शन किया जाता है एक नियंत्रण हमेशा इस्तेमाल किया जाना चाहिए. एक वांछित समाधान के साथ स्पंज इंजेक्षन करने के लिए, पहली बार माउस को प्रशासन पदार्थ की राशि का निर्धारण करते हैं. पदार्थ पर ध्यान केंद्रित किया है ताकि इंजेक्शन की मात्रा आधे से भी कम कुल मात्रा स्पंज पकड़ कर सकते हैं की जरूरत है. इंजेक्शन (चूहों हम एक 28 जी सुई का उपयोग करें के लिए) के लिए एक सिरिंज तैयार. संज्ञाहरण के तहत इंजेक्शन प्राप्त करने के लिए पशु रखें. इंजेक्शन कर सकते हैं जब जानवर अब चुटकी परीक्षण का जवाब दिया जाना है. स्पंज के केन्द्र में एक 45 ° कोण पूरी तरह से त्वचा में इंजेक्शन सुई धक्का दे. तो स्पंज में सुई धक्का केवल आधे रास्ते जाइसकी मोटाई के माध्यम से. लक्ष्य स्पंज की सटीक केंद्र में इंजेक्षन है. जाँच करने के लिए सुनिश्चित करें कि सुई स्पंज में है, धीरे से सुई खड़ी उठा. यदि सुई स्पंज में है, स्पंज सुई के साथ बढ़ना चाहिए. धीरे धीरे स्पंज में इंजेक्षन और सुई को हटा दें. यदि एकाधिक इंजेक्शन की आवश्यकता स्पंज यह संभव है कि इंजेक्शन तरल पदार्थ के कुछ इंजेक्शन के पिछले साइटों के बाहर धक्का दे दिया जाएगा. 4. स्पंज निकालना नोट:. स्पंज हटाने के दौरान, अतिरिक्त सावधानी के साथ स्पंज संभाल. शल्य चिकित्सा उपकरणों के साथ स्पंज मर्मज्ञ से बचें और आसपास के ऊतकों भर के प्रमुख धमनियों से बचने के द्वारा स्पंज में अत्यधिक रक्तस्राव को रोकने के. के बाद पशु euthanized है, त्वचा एक चिमटी का उपयोग कर और एक चीरा स्पंज बंद पकड़े द्वारा स्पंज को दूर. आसपास के कैप्सूल एक स्पंज से ध्यान से अलग एन डी अतिरिक्त ऊतक आसपास के स्पंज कटाई से बचें. जैसे दवा वितरण या morphometry के assays के लिए, कम सटीकता छांटना के लिए आवश्यक है. 5. प्रतिनिधि परिणाम हटाया स्पंज अलग विश्लेषण के प्रकार है कि प्रदर्शन किया जाएगा पर निर्भर करता है शर्त के तहत संग्रहीत किया जा सकता है. प्रोटोकॉल के लिए, पुनः प्राप्त स्पंज ऐसी इष्टतम काटना (OCT) तापमान परिसर के रूप में ठंड के लिए एक माध्यम में एम्बेड किया जा सकता है या एम्बेड और तेल ब्लॉक (चित्रा 3 ए और बी) में प्रोटोकॉल के लिए 10 formalin% में रखा. प्रोटोकॉल के लिए सबसे अच्छा परिणाम प्राप्त कर रहे हैं जब स्पंज व्यास भर में आधे में कट जाता है और एम्बेडेड सतह कटौती नीचे (चित्रा -4 ए और बी). स्पंज की धारा इतना स्पंज की है कि पूरी चौड़ाई मौजूद है लिया जाना चाहिए चित्रा 3A दो स्पंज से पता चलता है. बाईं स्पंज एम्बेडेड / किया गया था sectioned को गलत ढंग से और सही स्पंज सही ढंग से संसाधित किया गया था. > ईएनटी "विश्लेषण के लिए, स्पंज Eppendorf ट्यूब में रखा जा सकता है और -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत प्रसंस्करण के लिए तैयार है जब तक शाही सेना और मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर विश्लेषण स्पंज Eppendorf ट्यूब, फ्लैश जमे हुए, में रखा जाना चाहिए और में संग्रहीत. 80 ° सी. इसके अलावा, QIAGEN से RNAlater के रूप में एक शाही सेना परिरक्षक, उच्च तापमान पर सुरक्षित भंडारण के लिए शाही सेना को स्थिर करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है घाव द्रव ट्यूब से अधिक स्पंज फैलाएंगे द्वारा एकत्र किया जा सकता है, और एक साथ पूलिंग से तरल पदार्थ कई के लिए एक प्रतिनिधि नमूने प्राप्त स्पंज fibroblast मैक्रोफेज, और लिम्फोसाइटों के रूप में लाइव कोशिकाओं,. भी स्पंज से निकाले जा सकता जानवर से हटाने के बाद, स्पंज जगह कक्षों की इच्छित प्रकार के लिए एक उपयुक्त मीडिया में हो सकता है. स्पंज कर सकते हैं शारीरिक (नख़रेबाज़ अर्थात्) या एंजाइमी तरीकों (यानी Collagenase) कोशिकाओं द्वारा जारी संसाधित. चित्रा 1 Dehydra.तीन अलग अलग आकारों में टेड PVA स्पंज डिस्क. चित्रा 2 माउस घाव चिकित्सा पार्श्व घाव और चार PVA स्पंज की स्थिति दिखाने के मॉडल की छवि. चित्रा 3. (ए) 4x में और एच ई धुंधला हो जाना और (ख) sectioned आयल एम्बेडेड स्पंज की 10x पर Trichrome धुंधला हो जाना. चित्रा 4. (ए) स्पंज व्यास के साथ आधे में कटौती की छवि. (बी) PVA स्पंज आधा, एम्बेडेड पक्ष अक्तूबर में कटौती.

Discussion

<p class="jove_content"> घाव भरने के स्पंज मॉडल के कई रूपों है, यह मनुष्य और स्पंज सहित कई अलग अलग प्रजातियों में किया जा सकता है भी पीछे की ओर प्रत्यारोपित किया जा सकता है<sup1,2,8></sup>. मनुष्य और कुछ अन्य प्रजातियों में अध्ययन के लिए, स्पंज के लिए एक झरझरा सिलिकॉन टयूबिंग में रखा जाना चाहिए करने के लिए समझाया जा रहा से स्पंज को रोकने के लिए और हटाने के आराम की अनुमति कर सकते हैं<sup4,8></sup>. इच्छित परिणाम और तकनीशियन के कौशल पर आधारित स्पंज आरोपण का स्थान बदला जा सकता है. पृष्ठीय आरोपण स्पंज त्वचा के नीचे स्थानांतरित करने के लिए, जबकि उदर प्रत्यारोपण अधिक उदर गुहा के माध्यम से कटौती की संभावना की वजह से मुश्किल कर रहे हैं की अनुमति कर सकते हैं. स्पंज एक कैथेटर के साथ स्थापित किया जा सकता इतना है कि दवा वितरण निरंतर और नियंत्रित है, एकाधिक इंजेक्शन की आवश्यकता को नष्ट करने<sup9></sup>. छोटे, ट्यूबलर स्पंज भी एक सुई के माध्यम से इंजेक्ट किया जा सकता है<sup8></sup>. 'स्पंज रचना के केवल polyvinyl शराब तक सीमित नहीं है. वे कई सामग्री विशेष रूप से या संयोजन में तैयार किया जा सकता है⁷.</p><p class="jove_content"> यह स्पंज तैयारी और जानवर में नियुक्ति करने के लिए लगातार और ठीक से समझ के लिए महत्वपूर्ण है. अगर स्पंज शीट से काट रहे हैं वे तुलनात्मकता के लिए समान वजन का होना चाहिए. अगर स्पंज कक्षों या एक इलाज के साथ लोड किया जा सकता है, प्रत्येक स्पंज में रखा राशि सटीक होना चाहिए. घाव भरने की प्रक्रिया और पशु चिकित्सा में स्पंज की नियुक्ति के स्थान के आधार पर भिन्न सिर बढ़ जाती है दूरी के रूप में कम हो जाएगा कर सकते हैं<sup1,10></sup>.</p

Materials

Material Name	Company	Catalogue number	Comments
PVA Sponge	Medtronic	CF120	The size and porosity of the sponge depends on the experiment
Scalpel blade size 15	BD Medial	371115
Metzembaum scissors	Thermo Scientific	79-211
Hemostat Forceps	Fine Science Tools	13004-14
Needle holder	Fine Science Tools	12004-16
5-0 nylon suture	Ethilon	698
O.C.T. compound	Tissue-Tek	4583