Karyotyping ספקטרלי (שמים) היא טכניקה מתקדמת cytogenetics לזהות סטיות כרומוזומליות גנומית. שיטה זו מנצלת את בדיקות ציור כרומוזום, המאפשרים סיווג של כרומוזומים כל. SKY יכול גם לזהות סטיות כרומוזום מורכבים ופגמים הפרדה בעכברים ובבני אדם עם מחלות שונות, לרבות מחלת כליות פוליציסטיות.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
Karyotyping רפאים ללמוד חריגות כרומוזום בבני אדם ועכברים עם מחלת כליות פוליציסטיות
במאמר זה
סיכום
תקציר
השיטה המקובלת לזהות ולסווג כרומוזומים בודדים תלוי בדגם פסים ייחודי של כל כרומוזום בעוד כמה מינים ספציפיים שאנו מנתחים 1, 2. זו טכניקה קלאסית פסים, לעומת זאת, אינה אמינה בזיהוי סטיות כרומוזומליות מורכבים, כגון אלה הקשורים בסרטן. כדי להתגבר על המגבלות של טכניקה פסים, Karyotyping ספקטרלית (SKY) הוא הציג לספק מידע אמין יותר על אי תקינות הכרומוזומים.
SKY היא הקרינה ססגוניות in-situ הכלאה (דגים) טכניקה לזהות כרומוזומים metaphase עם מיקרוסקופ רפאים 3, 4. SKY הוכח להיות כלי רב ערך לניתוח cytogenetic של מגוון רחב של מומים כרומוזום הקשורים למספר רב של מחלות גנטיות ומחלות ממאירות 5, 6. SKY כרוכה בשימוש של בדיקות ה-DNA ססגוניות fluorescently שכותרתו שהוכנו oligonucle מנוונתprimers otide על ידי PCR. לכן, כל כרומוזום יש צבע ייחודי רפאים לאחר ההכלאה in-situ עם בדיקות, אשר שכותרתו דיפרנציאלי בתערובת של צבעי ניאון (Rhodamine, טקסס רד, Cy5, FITC ו Cy5.5). בדיקות המשמשות SKY מורכב של עד 55 בדיקות ספציפיות כרומוזום 7-10.
הליך SKY כרוכה במספר שלבים (איור 1). SKY דורש זמינות של תאים עם מדד mitotic גבוהה מן הרקמות או חולה או דם. הכרומוזומים של תא בודד מתא בודד או העיקרי טרי או שורת תאים מפוזרים על שקופיות זכוכית. התפשטות זו כרומוזום מסומן עם שילוב שונה של צבעי ניאון ספציפיים עבור כל כרומוזום. בדיקה לאיתור ורכישת תמונה, מערכת דימות ספקטרלי מורכב interferometer sagnac ומצלמת CCD. זה מאפשר מדידה של ספקטרום האור הנראה הנפלט המדגם לרכוש תמונת רפאים הלוך ושובמ כרומוזומים בודדים. HiSKY, תוכנה להשתמש כדי לנתח את התוצאות של תמונות שנתפסו, מספק זיהוי קל של אנומליות כרומוזום. התוצאה הסופית היא metaphase ו סיווג קריוטיפ התמונה, שבה כל זוג כרומוזומים יש צבע מיוחד (איור 2). זה מאפשר זיהוי קל של זהויות כרומוזום translocations. לפרטים נוספים, בקר באתר יישומי הדמיה ספקטרלית ( http://www.spectral-imaging.com/ ).
SKY שימש לאחרונה לזיהוי ההפרדה פגמים כרומוזום הפרעות כרומוזום בבני אדם ועכברים עם מחלת כליות פוליציסטית אוטוזומלית דומיננטית (ADPKD), מחלה גנטית המאופיינת בתפקוד ב cilia העיקרי 11-13. באמצעות טכניקה זו, הפגנו נוכחות של הפרדה כרומוזום נורמלי פגמים כרומוזומליים בחולים ADPKD ומודלים עכבר 14. ניתוחים נוספים באמצעות SKY לא רק מאפשר לנו לזהות את מספר הזהות ואת כרומוזומליות, אלא גם כדי לזהות במדויק סטיות כרומוזומליות מורכבים מאוד כגון מחיקות כרומוזום טרנסלוקציות (איור 2).
פרוטוקול
1. התא טיפול מקדים והכנה metaphase
- התאים גדלים שינוי של Dulbecco בינוני של הנשרים (DMEM) המכיל 10-15% בסרום שור עוברית (FBS) ו 1% פניצילין / סטרפטומיצין על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2 באינקובטור, עד שהם מגיעים 70-80% confluency.
- פנקו את התאים עם פתרון colcemid ב 0.05 מיקרוגרם / מ"ל 30-60 דקות.
- איסוף הבינוני המכיל את כל התאים הצפים בתוך 50 מ"ל צינורות סטריליים בז צנטריפוגות. שוטפים את התאים בצלחת עם sterile1X-PBS. לאחר דוגרים עם ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
Karyotyping ספקטרלי (שמים) היא טכניקה cytogenetics השתמשו בלימוד יצירות גנומית כרומוזומלית. שיטה זו מנצלת את בדיקות ציור כרומוזום, ואת גילוי של בדיקות אלה נרכשים דרך interferometer sagnac. תהליך SKY מלאה בדרך כלל לוקח בערך שבוע, והיא כוללת מספר שלבים עיקריים (איור 1). SKY משתמשת בפרוטוקול סטנדרטי, אשר תואר לראשונה על ידי פדייה, נאש ואח' 3. פרוטוקול מאז מותאם על ידי מעבדות cytogenetics שונים, כולל שלנו.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
אין ניגוד עניינים הצהיר.
תודות
המחברים מבקשים להודות בריאן Muntean, שאו הנה מאקי טקהאשי ובלייר מל לקבלת סיוע טכני שלהם. עבודה זו נתמכה על ידי פרסים מ-NIH (DK080640) ואת אוניברסיטת טולדו & ProMedica פרס גירוי Translational מחקר של ד"ר Surya נאולי.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| שם מגיב | חברה | מספר קטלוגי | תגובות |
| DMEM | Cellgro Mediatech בע"מ | 10-013-CV | |
| העובר שור בסרום (FBS) | Hyclone | SH30088-03 | |
| Penecillin / סטרפטומיצין | Thermo Scientific | SV30010 | |
| Colcemid | Roche Diagnostics | 10 295 892 001 | 10 מיקרוגרם / מ"ל |
| HCl | פישר סיינטיפיק | A144-500 | |
| KCl | פישר סיינטיפיק | S77375-1 | |
| פוספט שנאגרו מלוחים | Thermo Scientific | SH30256-01 | |
| צבע SKY ערכת בדיקה (האדם) | Spectral Imaging יישומית | SKY000028 | |
| צבע SKY ערכת בדיקה (עכבר) | Spectral Imaging יישומית | SKY000030 | |
| נוגדנים מרוכזת איתור ערכת | Spectral Imaging יישומית | SKY000033 | |
| טריפסין | Thermo Scientific | SH30236.01 | |
| מתנול | פישר סיינטיפיק | A433P-4 | |
| חומצה אצטית | פישר סיינטיפיק | A38-212 | |
| RNase | Roche Diagnostics | 10 109 169 001 | |
| עכלן | Sigma-Aldrich | P6887-5G | |
| MgCl 2 | Fluka | 63069-500ml | |
| 37% פורמלדהיד | Mallinckrodt בייקר | 2106-02 | |
| 20X SSC | Promega | V4261 | |
| לפוראמיד | Fluka | 47671 | להכין ממש לפני השימוש |
| Tween-20 | פישר סיינטיפיק | BP337-500 | |
| זכוכית מיקרוסקופ שקופיות | פישר סיינטיפיק | 12-549 | |
| כיסוי זכוכית מיקרוסקופ 24x60mm | VWR Vista חזון | 16004-312 | |
| גומי מלט | אלמר של (הפצה מסחרית מקומית) | ||
| ההכלאה / humidifiedchamber / מגש | Simport | M920-2 | לשים מגבות נייר רטובות בתחתית |
| ThermoCycler | Eppendorf | Epgradient S | |
| רועד פלטפורמה / Orbital שאכר | Bellco ביוטכנולוגיה | ||
| אמבטיה / מים רועדת | דיוק מדעי | ||
| DAPI קוביית המסנן | Chroma טכנולוגיה | ||
| SKY קוביית המסנן | Chroma טכנולוגיה | ||
| SpectraCube | Spectral Imaging יישומית | ||
| תא הפוכה תרבות מיקרוסקופ | ניקון | Nikon TS100 Eclipse | |
| מיקרוסקופ פלואורסצנטי | אולימפוס | IX70 | 60x שמן |
מקורות
- Caspersson, T., Farber, S., Foley, G. E., Kudynowski, J., Modest, E. J., Simonsson, E., Wagh, U., Zech, L. Chemical differentiation along metaphase chromosomes. Experimental Cell Research. 49, 219-222 (1968).
- Seabright, M. A rapid banding technique for human chromosomes. Lancet. 2
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
