스펙트럼 Karyotyping (SKY)는 게놈 및 염색체 aberrations를 식별하기위한 고급 cytogenetics의 기술이다. 이 기술은 모든 염색체의 분류를 허용하는 염색체 페인팅 프로브를 이용 걸립니다. 스카이는 또한 polycystic 신장병 등 각종 질병을 가진 생쥐와 인간의 복잡한 염색체 aberrations 및 분리 결함을 식별할 수 있습니다.
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방법 논문
Polycystic 신장 질환과 함께 인간과 마우스의 염색체 이상을 공부하는 스펙트럼 Karyotyping
이 논문에서
요약
초록
식별하고 각각의 염색체를 분류하는 종래의 방법은 1, 2를 분석중인 특정 종족의 각 염색체의 독특한 banding 패턴에 따라 달라집니다. 이것은 고전 banding 기술은 그러나, 그러한 암과 연관된 것과 같은 복잡한 염색체 aberrations을 확인하는 신뢰할 수 없습니다. banding 기술의 한계를 극복하기 위해 스펙트럼 Karyotyping (SKY)는 염색체 이상에 대한 많은 신뢰할 수있는 정보를 제공하기 위해 도입된다.
하늘은 여러 가지 빛깔의의 형광에 원위치 하이브리드화 (물고기) 분광 현미경 3, 4 metaphase 염색체를 감지하는 기술입니다. 하늘이 유전 질환과 malignancies 5, 6의 큰 번호와 연관된 염색체 이상의 광범위한 범위의 cytogenetic 분석에 유용한 도구로 입증되었습니다. 하늘은 타락한 oligonucle에서 준비한 여러 가지 빛깔의 fluorescently-라벨의 DNA 프로브의 사용과 관련된PCR에 의한 otide primers. 따라서, 모든 염색체는 differentially 형광 염료의 혼합물 (Rhodamine, 텍사스 빨강, Cy5, FITC와 Cy5.5)으로 표시되는 프로브와 원위치 하이브리드화 후 독특한 스펙트럼 색상을 가지고 있습니다. SKY에 사용되는 프로브는 7-10 55 번 염색체 특정 프로브에로를 구성됩니다.
SKY에 대한 절차는 여러 단계 (그림 1)을 포함한다. 스카이는 정상이나 병에 걸린 조직이나 혈액에서 높은 mitotic 지수와 세포의 가용성을 필요로합니다. 갓 격리 기본 셀 또는 셀 라인 중 하나에서 단일 세포의 염색체는 유리 슬라이드에 전파됩니다. 이 염색체 확산은 각 염색체의 특정 형광 염료의 다른 조합으로 표시됩니다. 프로브 감지 및 이미지 수집의 경우 스펙트럼 이미징 시스템 sagnac 간섭계와 CCD 카메라로 구성되어 있습니다. 이것은 시료로부터 방출되는 가시 광선 스펙트럼의 측정이 가능하며 오가는 스펙트럼 이미지를 얻기 위해m 각 염색체. HiSKY, 촬영된 이미지의 결과를 분석하는 데 사용되는 소프트웨어는 염색체 이상 현상의 쉬운 식별을 제공합니다. 최종 결과는 metaphase와 염색체의 각 페어는 독특한 컬러 (그림 2)를 가지고있는 핵형 분류 이미지입니다. 이것은 염색체 정체성과 translocations을 쉽게 식별할 수 있습니다. 자세한 내용은 응용 스펙트럼 이미징 홈페이지를 (참조하십시오 http://www.spectral-imaging.com/ ).
스카이는 최근 염색체 분리 결함 및 Autosomal 지배 Polycystic 신장 질환 (ADPKD), 기본 속눈썹 11-13의 장애가 특징 유전 질환과 인간과 생쥐의 염색체 이상의 식별을 위해 사용되었다. 이 기법을 사용하여, 우리는 ADPKD 환자와 마우스 모델 14 비정상적인 염색체 분리 및 염색체 결함의 존재를 증명. SKY를 사용하여 더 자세한 분석은 우리가 염색체 번호와 ID를 식별하는 것이 아니라 정확하게 같은 염색체 삭제 및 translocations (그림 2)와 같은 매우 복잡한 염색체 aberrations를 검색할 수 없습니다 전용.
프로토콜
1. 세포 전처리와 metaphase 준비
- 그들이 70~80%가 confluency 도달할 때까지 세포는 5 % CO 2 배양기로 37 10-15% 태아 소 혈청 (FBS) 및 1퍼센트 페니실린 / 스트렙토 마이신 ° C를 포함하는 이글 배지 (DMEM)의 Dulbecco의 변경 재배하고 있습니다.
- 0.05 μg / 30-60 분 ML에 colcemid 솔루션 세포를 드셔보세요.
- 50-ML 멸균 매의 원심 튜브에 어떤 떠다니는 세포를 포함하는 매체를 수집합니다. sterile1X-PBS로 접시에 세포를 씻어. 1-2 분, 추수와 같은 튜브에 남아있는 세포를 수집을 위해 멸균 트립신과 잠복기 후에.
- 5 분, 1,000 rpm으로 튜브 던가, 뜨는 떠나는 0.5 ML을 대기음 오직 손가락으로 flicking하여 펠렛을 푸세요.
- 펠렛의 크기에 따라, DH 2 O에서 0.56 %의 KCl의 hypotonic 솔루션의 5-10 ML을 추가하고 30-45 분 동안 37 ° C에서 정학을 품어.
- 메탄올 / 초산 한 방울 추가(3시 1분 권 / 권) 당 ML hypotonic 세포 현탁액과 믹싱을 위해 부드럽게 튜브를 바꾸란.
- contino....
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토론
스펙트럼 Karyotyping (SKY)는 게놈 및 염색체 작곡을 공부에 사용 cytogenetics의 기술이다. 이 기술은 염색체 페인팅 프로브 활용, 이러한 프로브 감지 sagnac 간섭계를 통해 찾았습니다. 전체 SKY 과정은 보통 일주일에 하루는 걸립니다, 그리고 몇 가지 주요 단계 (그림 1)을 포함한다. SKY 먼저 빠디야-내시 외 3 설명한 표준 프로토콜을 사용합니다. 프로토콜은 이후 우리를 포함한 다양한 cytogenetics 연구소에 의해 적응되었습니다.
프로토콜의 주요 단계 중에서 양질의 metaphase 준비는 성공적인 스카이 분석을 가지고 매우 중요합니다. 염색체 너무 많은 세포질이 있거나하면 슬라이드가 너무 오래된 경우 예를 들어, 이미지의 품질이 위험 수 있습니다. 우리의 동영상 클립에서 본 바와 같이, 세포질의 내용은 쉽게 차동의 높은 해상도를 사용하여 확인할 수 있습니다간섭 대비 현.......
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공개 사항
관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.
감사의 글
저자는 기술 지원을 위해 브라이언 Muntean, Shao 소호, 마키 다카하시와 블레어 MELL 감사드립니다. 이 작품은 NIH (DK080640) 및 박사 Surya Nauli로 톨레도 & ProMedica Translational 연구 자극 수상의 대학에서 수상에 의해 지원되었다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 시약의 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
| DMEM | Cellgro Mediatech 주식 회사 | 10-013 - 이력서 | |
| 태아 소 혈청 (FBS) | Hyclone | SH30088-03 | |
| Penecillin / 스트렙토 마이신 | 써모 과학 | SV30010 | |
| Colcemid | 로슈 진단 | 10 295 892 001 | 10 μg / ML |
| HCL | 피셔 과학 | A144-500 | |
| KCl | 피셔 과학 | S77375-1 | |
| 인산염은 염분 버퍼 | 써모 과학 | SH30256-01 | |
| 스카이 페인트 프로브 키트 (인간) | 응용 스펙트럼 이미징 | SKY000028 | |
| 스카이 페인트 프로브 키트 (마우스) | 응용 스펙트럼 이미징 | SKY000030 | |
| 농축 항체 검출 키트 | 응용 스펙트럼 이미징 | SKY000033 | |
| 트립신 | 써모 과학 | SH30236.01 | |
| 메탄올 | 피셔 과학 | A433P-4 | |
| 초산 | 피셔 과학 | A38-212 | |
| RNase | 로슈 진단 | 10 109 169 001 | |
| 펩신 | 시그마 - 올드 리치 | P6887-5G | |
| MgCl 2 | Fluka | 63069-500ML | |
| 37%의 포름 알데히드 | Mallinckrodt 베이커 | 2106-02 | |
| 20X SSC | Promega | V4261 | |
| 포름 아미드 | Fluka | 47,671 | 사용하기 전에 그냥 준비 |
| 십대 초반-20 | 피셔 과학 | BP337-500 | |
| 현미경의 유리 슬라이드 | 피셔 과학 | 12-549 | |
| 현미경 덮개 유리 24x60mm | VWR 비스타 비전 | 16004-312 | |
| 고무 시멘트 | 엘머 (현지 소매점) | ||
| 하이브리드화 / humidifiedchamber / 트레이 | Simport | M920-2 | 하단에 젖은 종이 수건을 넣어 |
| 써모자전거 타는 사람 | Eppendorf | Epgradient S | |
| 플랫폼을 떨고 / 궤도 흔드는 | Bellco 생명 공학 | ||
| 흔들어봐 / 물 목욕 | 정밀 과학 | ||
| DAPI 필터 큐브 | 채도 기술 | ||
| SKY 필터 큐브 | 채도 기술 | ||
| SpectraCube | 응용 스펙트럼 이미징 | ||
| 거꾸로 세포 배양 현미경 | 니콘 | 니콘 이클립스 TS100 | |
| 형광 현미경 | 올림포스 산 | IX70 | 60X 오일 |
참고문헌
- Caspersson, T., Farber, S., Foley, G. E., Kudynowski, J., Modest, E. J., Simonsson, E., Wagh, U., Zech, L. Chemical differentiation along metaphase chromosomes. Experimental Cell Research. 49, 219-222 (1968).
- Seabright, M. A rapid banding technique for human chromosomes. Lancet. 2
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재인쇄 및 허가
