Cariotipagem espectral (SKY) é uma técnica avançada citogenética para identificar as aberrações cromossômicas e cromossômicas. Essa técnica leva vantagem das sondas cromossômicas de pintura, que permitem a classificação de todos os cromossomos. SKY também pode identificar aberrações cromossômicas e defeitos complexos de segregação em camundongos e humanos, com várias doenças, incluindo doença renal policística.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
Cariotipagem espectral para o Estudo de Anomalias cromossômicas em humanos e camundongos com doença renal policística
Neste artigo
Resumo
Resumo
Método convencional para identificar e classificar cromossomos individuais depende do padrão único de bandagem de cada cromossomo em uma espécie específicos que estão sendo analisados 1, 2. Esta técnica clássica de bandagem, no entanto, não é confiável na identificação de complexos aberrações cromossômicas, tais como aqueles associados com o câncer. Para superar as limitações da técnica de anilhamento, cariotipagem espectral (SKY) é introduzido para fornecer informações confiáveis tanto em anormalidades cromossômicas.
SKY é uma fluorescência multicolor hibridização in-situ (FISH) técnica para detectar cromossomos em metafase, com microscópio espectral 3, 4. SKY tem sido comprovada para ser uma ferramenta valiosa para a análise citogenética de uma ampla gama de anormalidades cromossômicas associados com um grande número de doenças genéticas e doenças malignas 5, 6. SKY envolve o uso de sondas de DNA multicolor fluorescentemente-com o Rótulo preparados a partir de o oligonucle degenerarprimers otide por PCR. Assim, cada cromossoma tem uma cor exclusiva espectral depois de hibridização in-situ com sondas, que são diferencialmente rotulados com uma mistura de corantes fluorescentes (Rodamina, Texas Vermelho, Cy5, FITC e Cy5.5). As sondas utilizadas para SKY consistir de até 55 sondas cromossômicas específicas 7-10.
O procedimento para a SKY envolve várias etapas (Figura 1). SKY exige a disponibilidade de células com alto índice mitótico a partir de tecido normal ou doente ou sangue. Os cromossomos de uma única célula a partir de qualquer célula de um recém-isolado primária ou uma linha de células estão espalhados em um slide de vidro. Esse spread cromossomo é rotulado com uma combinação diferente de corantes fluorescentes específicos para cada cromossomo. Para a detecção da sonda e de aquisição de imagem, o sistema de imagem espectral consiste de interferômetro de Sagnac e uma câmera CCD. Este permite a medição do espectro de luz visível emitida a partir da amostra e para adquirir uma imagem espectral frocromossomos m individuais. HiSKY, o software usado para analisar os resultados das imagens capturadas, proporciona uma fácil identificação de anomalias cromossômicas. O resultado final é uma metáfase e uma imagem de classificação cariótipo, no qual cada par de cromossomos tem uma cor distinta (Figura 2). Isso permite a fácil identificação de identidades cromossômicas e translocações. Para mais detalhes, visite o site da Imagem Aplicada (Spectral http://www.spectral-imaging.com/ ).
SKY foi recentemente usada para a identificação de defeitos cromossômicos de segregação e anormalidades cromossômicas em humanos e camundongos com doença renal policística autossômica dominante (ADPKD), uma doença genética caracterizada por uma disfunção em cílios 11-13. Usando esta técnica, foi demonstrada a presença de segregação cromossômica anormal e defeitos cromossômicos em pacientes DPRAD e modelos de mouse 14. Outras análises usando SKY não só nos permitiu identificar o número cromossômico e identidade, mas também para detectar com precisão muito complexos aberrações cromossômicas, como translocações e deleções cromossômicas (Figura 2).
Protocolo
1. Pré-tratamento de célula e preparação metáfase
- As células são cultivadas em alteraç de Dulbecco de Medium de Eagle (DMEM) contendo 10-15% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de penicilina / estreptomicina a 37 ° C, com 5% de CO 2 incubadora, até que eles chegar a 70-80% de confluência.
- Trate as células com solução de Colcemid em 0,05 ug / ml para 30-60 min.
- Recolher o meio contendo as células de flutuação em tubos estéreis de 50 ml de centrífuga de falcão. Lavar as células sobre a placa com sterile1X-PBS. Depois de incubar com tripsina estéril para 1-2 min, colheita e coletar as células restantes para dentro do tubo mesmo.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
Cariotipagem espectral (SKY) é uma técnica utilizada em citogenética estudar composições genômicas e cromossômicas. Essa técnica leva vantagem das sondas de pintura de cromossomos, ea detecção destas sondas são adquiridas através de um interferômetro de Sagnac. O processo de SKY completa geralmente leva cerca de uma semana, e ele, envolve várias etapas-chave (Figura 1). A SKY usa um protocolo padrão, que foi primeiramente descrita por Padilla-Nash et al 3. O protocolo já foi adaptado.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Agradecimentos
Os autores gostariam de agradecer Brian Muntean, Shao Lo, Maki Takahashi e Blair Mell para a sua assistência técnica. Este trabalho foi financiado por concessões do NIH (DK080640) e da Universidade de Toledo & ProMedica Prêmio Estímulo à Pesquisa Translacional Dr. Surya Nauli.
....Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Nome do reagente | Companhia | Número de Catálogo | Comentários |
| DMEM | Cellgro Mediatech Inc. | 10-013-CV | |
| Fetal de soro de bovino (FBS) | Hyclone | SH30088-03 | |
| Penecillin Estreptomicina / | Thermo Scientific | SV30010 | |
| Colcemid | Roche Diagnostics | 10 295 892 001 | 10 ug / ml |
| HCl | Fisher Scientific | A144-500 | |
| KCl | Fisher Scientific | S77375-1 | |
| Fosfato de solução salina tamponada com | Thermo Scientific | SH30256-01 | |
| SKY pintura sonda kit (Humana) | Aplicado imagem espectral | SKY000028 | |
| SKY pintura sonda kit (Mouse) | Aplicado imagem espectral | SKY000030 | |
| Kit de detecção de Concentrada anticorpo | Aplicado imagem espectral | SKY000033 | |
| Tripsina | Thermo Scientific | SH30236.01 | |
| Metanol | Fisher Scientific | A433P-4 | |
| O ácido acético | Fisher Scientific | A38-212 | |
| RNase A | Roche Diagnostics | 10 109 169 001 | |
| Pepsina | Sigma-Aldrich | P6887-5G | |
| MgCl 2 | Fluka | 63069-500ML | |
| Formaldeído 37% | Mallinckrodt Baker | 2106-02 | |
| 20X SSC | Promega | V4261 | |
| Formamida | Fluka | 47671 | preparar pouco antes de usar |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Vidro lâminas de microscópio | Fisher Scientific | 12-549 | |
| Microscópio tampa de vidro 24x60mm | VWR Vista Visão | 16004-312 | |
| Borracha cimento | Elmer (loja de varejo local) | ||
| Hibridação humidifiedchamber / / Bandeja | Simport | M920-2 | colocar toalhas de papel molhadas no fundo |
| Thermociclista | Eppendorf | Epgradient S | |
| Plataforma de agitação / agitador orbital | Bélico Biotecnologia | ||
| Agitando banheira / água | Precisão científica | ||
| DAPI cubo filtro | Tecnologia Chroma | ||
| SKY cubo filtro | Tecnologia Chroma | ||
| SpectraCube | Aplicado imagem espectral | ||
| Microscópio invertido cultura de células | Nikon | Nikon Eclipse TS100 | |
| Microscópio de fluorescência | Olimpo | IX70 | Óleo de 60X |
Referências
- Caspersson, T., Farber, S., Foley, G. E., Kudynowski, J., Modest, E. J., Simonsson, E., Wagh, U., Zech, L. Chemical differentiation along metaphase chromosomes. Experimental Cell Research. 49, 219-222 (1968).
- Seabright, M. A rapid banding technique for human chromosomes. Lancet. 2
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
