Nanodisc 지질 입자로 ABC의 전송의 Reconstitution을위한 단계별 방법

Summary

Nanodiscs는 인지질 이중층의 작은 패치로 막 단백질을 포함 작은 원반 모양의 입자입니다. 우리는 디스크에 MalFGK2 수송의 단계별 설립을 보여줍니다 시각적 프로토콜을 제공합니다.

Abstract

nanodisc는 discoidal 입자 (~ 10-12 nm의 넓은)는 트랩 막 단백질 인지질 이중층의 작은 패치로.입니다 nanodisc 특히 리간드 – 수용체 상호 작용의 맥락에서, 막 단백질을 공부에 특히 매력적인 옵션입니다. 방법은 Sligar에 의해 개척 및 동료는 apolipoprotein A1에서 파생 설계 높은 – 나선형 비계 단백질의 amphipathic 특성에 기반을두고 있습니다. 극지방의 수성 환경에 직면 반면 비계 단백질의 소수성 얼굴은 지질 이중층의 지방산 아실 사이드 체인과 상호 작용할 수 있습니다. 입자가 작은 균질하고 수용성이기 때문에 nanodiscs의 막 단백질의 분석은 리포좀에 비해 상당한 장점이 있습니다. 또한, 일반적으로 수용성 단백질에 예약 생​​화학 및 biophysical 방법이 적용하고 막 양쪽에서 할 수 있습니다. 이 시각 프로토콜에서, 우리는 잘 charac의 단계별로 reconstitution을 제시terized 세균 ABC의 전송, 남성 _MalFGK이 복잡. 디스크의 형성은 세제의 진보적 인 제거에있어 소수성 상호 작용에 따라 자기 조립 과정입니다. 우리는 필수적인 단계를 설명하고 우리는 집계 및 큰 polydisperse 리포좀과 같은 입자의 형성을 제한하기 위해 올바른 단백질 – 투 – 지질의 비율을 선택의 중요성을 강조 표시합니다. 간단한 품질은 디스크가 올바르게 재구성되었는지 확인 겔 여과 크로마토 그래피, 기본 겔 전기 영동 및 동적 광 산란 분광법으로 제어합니다.

Protocol

전체 Reconstitution 프로세스 reconstitution 과정은 세제 – solubilized phospholipids의 존재에 정화 MalFGK이 컴플렉스로 ​​막 비계 단백질 (MSP)를 혼합하여 시작합니다. 단계는 바이오 비즈 나 Amberlite (그림 1)라는 흡착제 폴리스티렌 소재로 세제의 느린 제거을합니다. 자동 조립 공정 때문에 소수성 phospholipids, MalFGK이 복잡하고 MSP amphipathic 단백질의 표면 ?…

Discussion

우리는 nanodiscs에 말토오스 수송의 reconstitution에 대한 간단한 절차를 설명합니다. 전송은 ATPase 활성 상태이며 수용성 바인딩 파트너 남성과의 상호 작용은 (그림 3) 재현 할 수 있습니다. nanodiscs에 전송의 성공 reconstitution 추가 biophysical 및 생화학 분석 방법을 엽니 다. 특히 관심 MalK ATPase 및 세제의 말토오스 수송 활동, 리포좀과 nanodiscs 체계적인 분석됩니다. ABC의 이동 장치는 전송 사?…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
Amicon Ultra-4 50K centrifugal filter	Millipore	UFC805008	Follow manufacturer’s protocol for proper use
Bio-Beads SM-2 Adsorbent	Bio-Rad	152-3920
E. coli total lipids	Avanti Polar Lipids	100500C	Dissolved in chloroform, handle as appropriate for an organic solvent
Ni sepharose HP resin	GE Healthcare	17-5268-01
Phosphorous standard solution	Sigma-Aldrich	P3869
pMSP1D1	Addgene	20061
Superdex 200 HR 10/300	GE Healthcare	17-5172-01
			Table I. Specific reagents.
			Name Composition Comments DDM stock 10% w/v DDM Resuspend in milliQ water and store at -20 °C MalFGK2 stock 1-2 mg/ml 50 mM Tris-HCl, pH7.9 100 mM NaCl 10% v/v glycerol 0.03% w/v DDM Store at -70 °C after purification MSP stock 10-15 mg/ml 50 mM Tris-HCl, pH7.9 100 mM NaCl 10% v/v glycerol Store at -70 °C after purification in <1 ml aliquots and avoid excessive freeze/thaw cycles Phospholipid stock 5 nM E. coli total lipids 0.5% w/v (10 mM) DDM 50 mM Tris-HCl, pH 7.9 50 mM NaCl Store at 4 °C for 1 week TS buffer 50 mM Tris-HCl, pH 7.9 50 mM NaCl Store at 4 °C TSG10 buffer 50 mM Tris-HCl, pH7.9 100 mM NaCl 10% v/v glycerol Store at 4 °C TSG20 buffer 50 mM Tris-HCl, pH8 100 mM NaCl 20% v/v glycerol Store at 4 °C TSGD buffer 50 mM Tris-HCl, pH7.9 100 mM NaCl 10% v/v glycerol 0.03% w/v DDM Store at 4 °C and add DDM just before use Table II. Solution recipes.