1. Probe Design Design anti-følelse DNA flislegging prober for selektiv uthenting av RNA mål av Chirp. Design anti-sense oligo probes i bruk den elektroniske sonden designer hos singlemoleculefish.com 18. Bruk disse parametrene: antall prober = 1 probe / 100 bp av RNA lengde, 2) Target GC% = 45, 3) Oligonucleotide lengde = 20, 4) Mellomrom lengde = 60-80. Bryt RNA inn i segmenter hvis for lang for designeren. Utelat områder av gjentakelser eller omfattende homologi. Bestill anti-sense DNA prober med BiotinTEG ved 3-prime end. Etiketten sonder etter sine posisjoner langs RNA. Skille dem i to bassenger, slik at "selv" pool inneholder alle sonder 2 nummerering, 4, 6 osv. og "odd" pool inneholder prober nummerering 1, 3, 5 osv. Fortynn pool av sonder til 100 mikrometer konsentrasjon og Oppbevar ved -20 ° C. Alle eksperimenter skal utføres ved hjelpbegge bassengene, som fungerer som interne kontroller for hverandre. Ekte RNA-avhengige signal ville være til stede fra begge bassengene, mens probe-spesifikke lyder ville være unik for hver pool. Dette gjelder for både kvitre-qPCR og chirp-seq. 2. Harvests Celler Samle celler som skal brukes til chirp eksperiment. Grow celler i vev kultur plater eller kolber til confluency. Skyll med fosfat saltløsning (PBS) én gang og trypsinize. Slukk trypsin med> 2x volum av media, pipette opp og ned for å løsne cellene og resuspender i single cellesuspensjon. Overfør alle medier og resuspendert celler inn i 50 ml Falcon rør. 20 millioner celler er vanligvis tilstrekkelig for en chirp prøve. Spinn cellene ved 800RCF for 4 min. Sug media og Resuspender 40 millioner celler i 40 ml PBS, kombinere rør om nødvendig. Spinn cellene ved 800RCF for 4 min. Dekanter PBS, forsiktig aspirer på en vinkel gjenværende væske. </ol> 3. Cross-link Cells og samle cellepelleten Kryssbindingsfordelingen samlet celler med glutaraldehyd å bevare RNA-Chromatin interaksjoner og forberede cellepelleten. Utfør alle trinnene ved romtemperatur. Forbered 1% glutaraldehyd i romtemperatur PBS. Forbered 10 ml per 10 millioner celler (0,4 ml 25% glutaraldehyd lager + 9,6 mL PBS). Glutaraldehyde må brukes fersk. Trykk bunnen av Falcon rør for å løsne pellets. Resuspender cellepelleten i 1% glutaraldehyd, starter med et lite volum for å unngå biter, deretter fylle opp til full volum. Inverter å blande. Kryssbindingsfordelingen for 10min ved romtemperatur på en ende-til-ende shaker eller rotator. Slukke kryssbinding reaksjon med 1/10th volum på 1,25 M glysin i romtemperatur i 5 min. Snurr på 2000RCF i 5 min. Aspirer supernatanten og vask pellet med 20 mL kjølt PBS gang, spinning på 2000RCF i 5 min. Aspirer og resuspender wforaskes, tverrbundet pellet med 1 ml kjølt PBS per 20 millioner celler. Overfør hver ml til en Eppendorf rør og spinn på 2000RCF for 3 min ved 4 C. Ta så mye PBS som mulig med pipettespissen nøye. Flash-fryse cellen pellets i flytende nitrogen og oppbevar ved -80 ° C på ubestemt tid. 4. Cellelyse Lyse krysskoblet celler til å forberede celle lysate. Tin frosne celle pellets ved romtemperatur. Trykk vanskelig å løsne og blande cellepelleten. Spinn ned pellet ved 2000RCF for 3 min ved 4 ° C. Bruk en skarp 10 mL pipette for å fjerne eventuelle gjenværende PBS. På en elektronisk balanse (nøyaktig til 1 mg) tara massen av en tom Eppendorf rør (våre rør veier 1.060 gram veldig konsekvent). Veie hver pellet og registrere sin vekt. En full 15 cm rett av tverrbundet Jakten celler veier vanligvis 100 mg. Supplement Lysis buffer (10X massen av pellets, en f.eks ml for 100 mg) med FRESh proteasehemmer, PMSF og Superase-i (se vedlagte buffer liste). Bland godt. Legg 10X volumet supplert Lysis Buffer til hvert rør og resuspender pelleten. For små pellets <25 mg, resuspender i 250 mL supplert lysis buffer. Suspensjon skal være glatt. Hvis ikke, dele suspensjonen i 500 mL alikvoter og bruke en motorisert pellet mikser til å bryte opp klumper. Fortsett straks til sonikator. 5. Sonikator Shear DNA ved sonicating krysskoblet celle lysates. Sonicate celle lysate i Bioruptor i 15 ml Falcon rør. Bruk <1,5 ml lysate i hvert rør, og for raskere sonikator, sonicate ikke mer enn to rørene på en gang. Sonicate i en 4 ° C vannbad ved høyeste innstilling med 30 sekunder på, 45 sekunder av puls intervaller. Sjekk lysate hvert 30 min. Fortsett sonicating inntil cellen lysate ikke lenger grumset. Dette kan ta så lite som 30 min og så mange som fire timer. Talletav rør, vil prøvevolum, badet temperatur, og perioden med sonikator tid påvirke hvor lang tid prosessen tar. Rør vil trolig sonicate ved ulike priser, så pool dem sammen hver 30 min og redistribuere inn originale rør for å sikre homogenitet. Merk: glutaraldehyd-krysskoblet celler tar vesentlig lengre tid å sonicate enn formaldehyd ekvivalenter. Når lysate snur klar, overføre 5 mL lysate til en frisk Eppendorf rør. Legg 90 mL DNA Protease K (PK) Buffer (se buffer liste) og 5 mL PK. Vortex å spinne og mixe ned kort. Inkuber i 45 min ved 50 ° C. Pakk DNA med Qiagen PCR rensing kit. Eluer DNA i 30 mL Qiagen eluering Buffer (EB) og sjekke DNA størrelse på 1% agarose gel. Dersom mesteparten av DNA smøre er 100-500 bp, er sonikator fullført. Hvis ikke, fortsetter å sonicate. Sentrifuger sonicated prøver på 16100RCF i 10 min ved 4 ° C. Kombiner supernatants, alikvoter i 1 ml prøver og flash-fryse i flytende nitrogen. Oppbevares ved -80 ° C. 6. Kvitre Hybridize biotinylated DNA prober til RNA og isolere bundet kromatin. Thaw rør av kromatin ved romtemperatur. Forbered Hybridisering Buffer (se buffer liste, forberede 2 ml per ml av kromatin). Vortex å blande. For en typisk kvitre prøve ved hjelp av 1 ml lysate, fjerne 10 mL for RNA-inngang og 10 mL for DNA-inngang og plass i Eppendorf-rør. Hold på is inntil videre bruk. Overfør 1 mL kromatin til 15 ml Falcon rør. Tilsett 2 mL Hybridisering Buffer til hvert rør. For total volum <1,5 ml, bruke Eppendorf-rør. Tin prober ved romtemperatur. Nanodrop prober for å sjekke beløpet hvis du ikke har brukt det i lang tid (100 mikrometer sondene skulle spec ~ 500-600 ng / mL hjelp enkelt strand DNA innstilling). Legg passende mengde prober til bestemte rør (100 pmol sonde per 1 ml kromatin, 1 mL av 100 pmol / mL probe per 1 ml kromatin).Bland godt. Inkuber ved 37 ° C i 4 timer med risting. Med 20 min igjen for hybridisering, forberede C-1 magnetiske kuler (som er lagret ved 4 º C). Bruk 100 mL per 100 pmol av sonder. Vask med 1 ml unsupplemented Lysis Buffer tre ganger, ved hjelp av DynaMag-2 magnet stripe til separate perler fra buffer. Resuspender perler i original volum av Lysis buffer; supplere med frisk PMSF, PI og Superase-in. Etter 4 timers hybridisering reaksjonen er ferdig, tilsett 100 mL perler i hvert rør. Bland godt. Inkuber ved 37 ° C i 30 min med risting. Forbered vaskebuffer (5 ml per prøve). Vortex å blande. Forvarm til 37 ° C. Legg PMSF før bruk. Vask perler med 1 ml vaskebuffer fem ganger. På den første vask, bruk DynaMag-15 magnetstripen til egne perler, decant og Resuspender i 1 ml vaskebuffer. Overføring volum til 1,5 ml Eppendorf rør. Inkuber ved 37 ° C med risting i 5 min. Ved senere vask, spinner ned hvert rør på en minicentrifugeSetter prøve på DynaMag-2 magnetstripen i 1 min. Dekanter prøven, tørke noen drypp med en Kimwipe, resuspender i 1 ml vaskebuffer. Inkuber ved 37 ° C med risting i 5 min. Gjenta i fem totalt vask. Endelig vask, resuspender perlene godt. Fjern 100 mL og satt til side for RNA isolering. Reserve 900 mL for DNA brøkdel. Plasser alle rør på DynaMag-2 magnetstripen og fjerne vaskebuffer. Spinn alle rør ned kort; plassere dem på magnet stripen. Fjern den siste bit av vaskebuffer helt med en skarp 10 mL pipette tips. 7. RNA Isolation Utdrag RNA brøkdel fra kvitre prøver å quantitate av Qrt-PCR. Ta 100 mL perle prøver og 10 mL RNA INPUT prøven. Legg 85 mL RNA PK Buffer pH 7,0 til RNA INPUT. Resuspender perler i 95 mL RNA PK Buffer pH 7,0. Tilsett 5 mL Proteinease K og Inkuber ved 50 ° C i 45 min med ende-til-ende risting. Kort spinne ned alle rør ogkoke prøver for 10 min på varme blokk ved 95 ° C. Chill prøver på is, tilsett 500 mL TRIzol, vortex kraftig i 10 sek. Inkuber ved romtemperatur i 10 min. Oppbevares ved -80 ° C eller gå videre til trinn 4. Tilsett 100 mL kloroform til TRIzol behandlet prøvene. Vortex kraftig i 10 sek. Snurr på 16100RCF på en stasjonær sentrifuge i 15 min ved 4 ° C. Fjern ~ 400 mL vandig supernatant, unngå organisk og grensesnitt. Legg 600 mL (1,5 volum) 100% etanol og bland godt. Spinn prøven gjennom MIRNeasy mini kolonner. Vask 1x med RWT (MIRNeasy mini kit), 2x med RPE per produsentens protokoll. Eluer med 30 mL nukleasefritt H 2 O (NFH 2 O). Unn RNA eluatet med DNA-free per produsentens protokoll. Etter at reaksjonen er ferdig, varme prøven i 15 minutter ved 65 ° C til helt inaktivere eventuelle gjenværende DNase. Bruk 1 mL RNA isolere per brønn for QRT-PCR-analyse for å bekrefte lncRNAhenting. GAPDH blir ofte brukt som en negativ kontroll. 8. DNA Utdrag DNA fraksjon fra kvitre prøver å identifisere ved sekvensering eller quantitate av qPCR. Forbered DNA eluering Buffer (se buffer liste), 150 mL per prøve, inkludert DNA INPUT. Tilsett 1 0μL RNase A (10 mg / ml) og 10 mL RNase H (10 U / mL) per ml av DNA eluering buffer, og virvle å blande. Resuspender hver prøve av perler i 150 mL av DNA eluering buffer med RNases. (Resuspender DNA INPUT i 140 mL) Inkuber ved 37 ° C i 30 min med risting. Separate perler og supernatanten på DynaMag-2 magnetstripen. Fjern supernatanten og legge til merket rør. Utarbeide en andre delmengde av DNA eluering buffer med 10 mL RNase A (10 mg / ml) og RNaseH (10 U / mL) nøyaktig som gjøres i 8.2). Tilsett 150 mL til hver prøve (inkludert DNA-inngang), inkuber, og fjern supernatanten. Samle all supernatanten (should være ~ 300 mL). Tilsett 15 mL PK til hver prøve. Inkuber ved 50 ° C i 45 min med risting. Pre-spinner ned gule fase-lock gel rør (5PRIME). Overføring DNA-prøver til fase-lock gel rør, og legg 300 mL PhOH: kloroform: Isoamyl per prøve. Rist kraftig i 10 min, og spinne ned på en Borstemmaskin sentrifuger ved 16100RCF i 5 min ved 4 ° C. Ta vandig fra toppen (~ 300 mL). Legg 3 mL GlycoBlue, 30 mL NaOAc, og 900 mL 100% EtOH. Bland godt og oppbevar ved -20 ° C over natten. Spinn prøver på 16100RCF i 30 min ved 4 ° C. Dekanter supernatanten forsiktig. Tilsett 1 ml 70% EtOH og virvle å blande. Snurr på 16100RCF i 5 min. Fjern supernatanten ved pipette. Lufttørke for 1min. Resuspender i 30 mL EB. DNA-prøver er klare for analyse av qPCR eller forberedelse av high-throughput sekvensering biblioteker per Illumina protokollen. 10. Representative Resultater Figur 1 </strong> skildrer chirp arbeidsflyten. En vellykket Chirp eksperiment beriker typisk target RNA betydelig over ikke-spesifikke RNA. Figur 2 viser anrikning av menneskelig telomerase RNA (TERC) fra Jakten celler enn GAPDH, et rikt cellulære RNA som fungerer som en negativ kontroll. Flertallet av TERC RNA (~ 88%) til stede i cellen ble dratt ned ved å utføre kvitre, mens bare 0,46% av GAPDH RNA ble hentet frem, viser en berikelse faktor på ~ 200 fold. Uspesifikke prober som prober rettet LacZ RNA, som ikke er uttrykt i pattedyrceller (figur 2), kan brukes som ekstra negative kontroller. DNA regioner forventes å binde målet lncRNA er typisk beriket enn negative regioner målt ved qPCR. Figur 3 viser qPCR validering av fire HOTAIR-bundet steder i primære humane foreskin fibroblaster at vi bestemt ved å utføre kvitre-seq i samme celle linje, mens TERC og GAPDH DNA-områder SErve som negativ kontroll regioner. Både "selv" og "odd" probe setter ga sammenlignbare anrikning av forventede HOTAIR-bundet områder enn negative regioner, et kjennetegn på ekte lncRNA-bindingssteder. High-throughput sekvensering av kvitre beriket DNA gir en global kart over lncRNA-bindingssteder. Den Drosophila lncRNA roX2 er kjent for å samhandle med X-kromosomet på en måte som er nødvendig for doseringen kompensasjon. Figur 4 viser roX2 binding profil over en del av X-kromosomet. Både "selv" og "rare" prøver har blitt sekvensert og deres unike lyder har blitt eliminert å produsere et spor av overlappende signaler. Hver "peak" indikerer her en sterk stedet roX2 bindende. Den komplette spor og liste over roX2 målgener har blitt beskrevet i Chu et al. 2011 17. Figur 1. Flow diagram av chirp proseDure. Kromatin er tverrbundet til lncRNA: protein-addukter i vivo Biotinylated fliser sonder er hybridisert å målrette lncRNA, og kromatin komplekser blir renset ved hjelp av magnetiske streptavidin perler, fulgt av strenge vasker.. Vi Eluer lncRNA bundet DNA eller proteiner med en cocktail av Rnase A og H. A antatte lncRNA bindende sekvensen er skjematisert i oransje. Tidligere publisert i Chu et al. 2011. 17 Figur 2. Kvitre beriker for menneskelig TERC RNA. TERC-asDNA prober hente ~ 88% av mobilnettet TERC RNA og undetectable GAPDH. LacZ-asDNA prober brukes som negative kontroller og hente verken RNAS. Mean + sd vises. Tidligere publisert i Chu et al. 2011. 17 Figur 3. HOTAIR kvitre-qPCR i primær menneskelig foreskin fibroblaster. NFKBIA, HOXD3-4, SERINC5 og ABCA2 er regioner som samhandler med HOTAIR. TERC og GAPDH fungerte som negative kontroller. Mean + sd vises. Tidligere publisert i Chu et al. 2011. 17 Figur 4. Kvitre-seq data av roX2 RNA i SL2 Drosophila celler. "Even" og "odd" ble sekvensert separat; sine data fusjonere å reflektere bare vanlige topper i begge. Det fusjonerte sporet vises. Tidligere publisert i Chu et al. 2011. 17