בידוד תרבות ראשונית של תאים בכבד עכברוש
Summary
Hepatocytes ראשיים מספקים כלי רב ערך כדי להעריך ביוכימיים, פונקציות מולקולרית, ואת חילוף החומרים במערכת ניסיונית רלוונטי מבחינה פיזיולוגית. אנו מתארים פרוטוקול אמין עכברוש זלוף הכבד באתרו, אשר באופן עקבי יוצר hepatocytes קיימא עד to1.0 × 10<sup> 8</sup> תאים לכל הכנה עם כדאיות התא בין 88 ~ 96%.
Abstract
תרבות hepatocyte העיקרית היא כלי רב ערך, שבו נעשה שימוש נרחב במחקר בסיסי של תפקודי כבד, מחלת פתופיזיולוגיה, פרמקולוגיה ונושאים קשורים אחרים. השיטה מבוססת על טפטוף שני שלבים collagenase עבור בידוד של hepatocytes שלמים הוצג לראשונה בשנת 1969 על ידי ברי 1 חברים ', ומאז עבר שינויים רבים. הטכניקה הנפוצה ביותר תוארה על ידי Seglenin 1976 2. בעיקרו של דבר, hepatocytes הם ניתק מן חולדות בוגרות הרדים ידי טפטוף בלתי הסירקולציה המחודשת collagenase דרך וריד השער. בתאים מבודדים מסוננים מכן דרך המסנן 100 מיקרומטר גודל הנקבוביות רשת ניילון, ותרבותיים על גבי צלחות. אחרי התרבות של 4 שעות, בינוני מוחלף בינוני סרום המכיל או בסרום ללא, למשל HepatoZYME-SFM, בפעם נוספת לתרבות. נהלים אלה מחייבים צעדים תרבות כירורגית סטרילית שיכולה לבוא לידי ביטוי טוב יותר מאשר טקסט ווידאו. Hפה, אנחנו מתעדים את השלבים מפורטים נהלים אלה של וידאו וגם פרוטוקול כתוב, אשר באופן עקבי לאפשר את הדור של hepatocytes קיימא במספרים גדולים.
Protocol
Discussion
התרבות העיקרית של hepatocytes הוא במודל חוץ גופית בשימוש נרחב ללמוד היבטים שונים של הכבד הפיזיולוגיה והפתולוגיה. לדוגמה, תרבות העיקרית שנועדה לבחון את הביטוי והתפקוד של סמים בחילוף חומרים אנזימים כולל cytochromes P450, מטבוליזם התרופה, אינטראקציות בין תרופתיות, ואת המנגנונ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מבקשים להודות למר ג'וש Basford וד"ר שיאו-min לי בבקשה לסיוע טכני. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי מענקים NIH (DK70992 ו DK92779 ל ML).
References
- Berry, M. N., Friend, D. S. High-yield preparation of isolated rat liver parenchymal cells: a biochemical and fine structural study. J. Cell Biol. 43, 506-520 (1969).
- Seglen, P. O. Preparation of isolated rat liver cells. Methods Cell Biol. 13, 29-83 (1976).
- Saito, K., Kobayashi, K., Mizuno, Y., Fukuchi, Y., Furihata, T., Chiba, K., Schmidt, M., Schmitz, H. J., Baumgart, A., Guedon, D. Peroxisome proliferator-activated receptor alpha (PPARalpha) agonists induce constitutive androstane receptor (CAR) and cytochrome P450 2B in rat primary hepatocytes. Drug Metab. Pharmacokinet. 25, 108-111 (2010).
- Gomez-Lechon, M. J., Donato, M. T., Castell, J. V., Jover, R. Human hepatocytes in primary culture: the choice to investigate drug metabolism in man. Curr. Drug Metab. 5, 443-462 (2004).
- Goncalves, L. A., Vigario, A. M., Penha-Goncalves, C. Improved isolation of murine hepatocytes for in vitro malaria liver stage studies. Malar. J. 6, 169 (2007).
- Bu, S. Y., Mashek, D. G. Hepatic long-chain acyl-CoA synthetase 5 mediates fatty acid channeling between anabolic and catabolic pathways. J. Lipid Res. 51, 3270-3280 (2010).
- Aiken, J., Cima, L., Schloo, B., Mooney, D., Johnson, L., Langer, R., Vacanti, J. P. Studies in rat liver perfusion for optimal harvest of hepatocytes. J. Pediatr. Surg. 25, 140-144 (1990).
- Jauregui, H. O., McMillan, P. N., Hevey, K., Naik, S. A quantitative analysis of lectin binding to adult rat hepatocyte cell surfaces. In Vitro Cell. 24, 401-412 (1988).
- Klaunig, J. E., Goldblatt, P. J., Hinton, D. E., Lipsky, M. M., Trump, B. F. Mouse liver cell culture. II. Primary culture. In Vitro. 17, 926-934 (1981).
- Hay, R. J. Operator-induced contamination in cell culture systems. Dev. Biol. Stand. 75, 193-204 (1991).
