डीएनए टुकड़े के पृथक्करण के लिए agarose जेल वैद्युतकणसंचलन
Summary
Agarose जेल वैद्युतकणसंचलन का उपयोग डीएनए टुकड़े की जुदाई के लिए एक बुनियादी प्रोटोकॉल में वर्णित है.
Abstract
Agarose gel electrophoresis is the most effective way of separating DNA fragments of varying sizes ranging from 100 bp to 25 kb1. Agarose is isolated from the seaweed genera Gelidium and Gracilaria, and consists of repeated agarobiose (L- and D-galactose) subunits2. During gelation, agarose polymers associate non-covalently and form a network of bundles whose pore sizes determine a gel's molecular sieving properties. The use of agarose gel electrophoresis revolutionized the separation of DNA. Prior to the adoption of agarose gels, DNA was primarily separated using sucrose density gradient centrifugation, which only provided an approximation of size. To separate DNA using agarose gel electrophoresis, the DNA is loaded into pre-cast wells in the gel and a current applied. The phosphate backbone of the DNA (and RNA) molecule is negatively charged, therefore when placed in an electric field, DNA fragments will migrate to the positively charged anode. Because DNA has a uniform mass/charge ratio, DNA molecules are separated by size within an agarose gel in a pattern such that the distance traveled is inversely proportional to the log of its molecular weight3. The leading model for DNA movement through an agarose gel is "biased reptation", whereby the leading edge moves forward and pulls the rest of the molecule along4. The rate of migration of a DNA molecule through a gel is determined by the following: 1) size of DNA molecule; 2) agarose concentration; 3) DNA conformation5; 4) voltage applied, 5) presence of ethidium bromide, 6) type of agarose and 7) electrophoresis buffer. After separation, the DNA molecules can be visualized under uv light after staining with an appropriate dye. By following this protocol, students should be able to:
1. Understand the mechanism by which DNA fragments are separated within a gel matrix
2. Understand how conformation of the DNA molecule will determine its mobility through a gel matrix
3. Identify an agarose solution of appropriate concentration for their needs
4. Prepare an agarose gel for electrophoresis of DNA samples
5. Set up the gel electrophoresis apparatus and power supply
6. Select an appropriate voltage for the separation of DNA fragments
7. Understand the mechanism by which ethidium bromide allows for the visualization of DNA bands
8. Determine the sizes of separated DNA fragments
Protocol
Discussion
Agarose जेल वैद्युतकणसंचलन nucleic एसिड को अलग करने का एक सक्षम और प्रभावी तरीके से साबित हो गया है. Agarose उच्च जेल ताकत बड़े डीएनए टुकड़े की जुदाई के लिए कम प्रतिशत जैल से निपटने के लिए अनुमति देता है. आणविक sieving agarose जेल मैट्रिक्स में 7 के बंडलों द्वारा उत्पन्न pores के आकार के द्वारा निर्धारित किया जाता है. सामान्य में, agarose, छोटे ध्यान में लीन होना आकार के उच्च एकाग्रता. पारंपरिक agarose जैल 100 बीपी और 25 केबी के बीच डीएनए टुकड़े की जुदाई में सबसे प्रभावी हैं. डीएनए 25 KB से बड़े टुकड़े को अलग करने के लिए, एक नाड़ी क्षेत्र जेल 6 वैद्युतकणसंचलन है, जो दो अलग अलग दिशाओं से वर्तमान alternating के आवेदन शामिल है का उपयोग करने की आवश्यकता होगी. इस तरह बड़े आकार डीएनए टुकड़े गति, जिस पर वे अपने मौजूदा दिशा में परिवर्तन के साथ नई दिशा से अलग हो रहे हैं. डीएनए 100 बीपी से छोटे टुकड़ों और अधिक प्रभावी ढंग से जेल वैद्युतकणसंचलन का उपयोग कर अलग हो रहे हैं. विपरीतagarose जैल, polyacrylamide जेल मैट्रिक्स एक मुक्त कट्टरपंथी प्रेरित रासायनिक प्रतिक्रिया के माध्यम से बनाई है. इन पतली जैल उच्च एकाग्रता के हैं, खड़ी कर रहे हैं चलाने के लिए और बेहतर संकल्प है. आधुनिक डीएनए अनुक्रमण केशिका electrophoresis प्रयोग किया जाता है, केशिका ट्यूब एक जेल मैट्रिक्स के साथ जिससे भर रहे हैं. केशिका ट्यूब का उपयोग उच्च voltages के आवेदन के लिए अनुमति देता है, जिससे डीएनए टुकड़े की जुदाई (और डीएनए अनुक्रम का निर्धारण) जल्दी से सक्षम करने के.
Agarose hydroxyethylation के माध्यम से कम पिघलने agarose बनाने के लिए संशोधित किया जा सकता है. कम पिघलने agarose आम तौर पर प्रयोग किया जाता है जब अलग डीएनए टुकड़े के अलगाव वांछित है. Hydroxyethylation agarose बंडलों की पैकिंग घनत्व, प्रभावी रूप से अपने ताकना 8 आकार को कम करने को कम कर देता है. इसका मतलब यह है कि एक ही आकार के डीएनए टुकड़ा अब लेने के लिए एक कम पिघलने agarose के रूप में एक मानक agarose जेल विरोध जेल के माध्यम से कदम होगा. क्योंकि बंडलों को एक दूसरे के साथ सहयोगीगैर सहसंयोजक 9 संपर्क के माध्यम से, यह संभव है कि फिर से पिघल एक agarose जेल के बाद यह स्थापित किया है.
EtBr सबसे आम के agarose जैल में 10 डीएनए दाग इस्तेमाल किया अभिकर्मक है. जब यूवी प्रकाश के संपर्क में, ethidium अणु के खुशबूदार अंगूठी में इलेक्ट्रॉनों को सक्रिय कर रहे हैं, जो इलेक्ट्रॉनों भूमि राज्य में लौटने के रूप में (प्रकाश) ऊर्जा की रिहाई की ओर जाता है. EtBr ही एक एकाग्रता निर्भर तरीके में डीएनए अणु में intercalating द्वारा काम करता है. यह किसी विशेष डीएनए इसकी तीव्रता के आधार पर बैंड में डीएनए की मात्रा के एक अनुमान के लिए अनुमति देता है. इसके सकारात्मक आरोप की वजह से, EtBr के उपयोग में 15% द्वारा डीएनए प्रवास दर कम कर देता है. EtBr एक संदिग्ध उत्परिवर्तजन और कैसरजन है, इसलिए ध्यान अभ्यास जब agarose यह जैल युक्त संभाल चाहिए. इसके अलावा, EtBr एक खतरनाक अपशिष्ट माना जाता है और उचित का निपटारा किया जाना चाहिए. Agarose जैल में डीएनए के लिए वैकल्पिक दाग SYBR गोल्ड, SYBR हरे, क्रिस्टल वायलेट और मिथाइल ब्लू शामिल हैं. इनमें से,मिथाइल ब्लू और क्रिस्टल वायलेट डीएनए बैंड के दृश्य के लिए यूवी प्रकाश के लिए जेल की जोखिम की आवश्यकता नहीं है जिससे उत्परिवर्तन की संभावना को कम करने अगर जेल से डीएनए टुकड़ा की वसूली वांछित है. हालांकि, उनकी संवेदनशीलता कि EtBr की तुलना में कम कर रहे हैं. SYBR सोना और SYBR हरे रंग दोनों बेहद संवेदनशील, EtBr से कम विषाक्तता के साथ यूवी रंगों निर्भर हैं, लेकिन वे काफी अधिक महंगे हैं. इसके अलावा, वैकल्पिक रंगों के सभी या तो हो सकता है या नहीं काम जब जेल से सीधे जोड़ा नहीं अच्छी तरह से कर सकते हैं, इसलिए जेल वैद्युतकणसंचलन के बाद पोस्ट दाग होना होगा. उपयोग की लागत, आराम, और संवेदनशीलता की वजह से, EtBr अभी भी कई शोधकर्ताओं के लिए पसंद की डाई बनी हुई है. हालांकि, जब खतरनाक अपशिष्ट निपटान मुश्किल या जब युवा छात्रों के रूप में कुछ स्थितियों में प्रदर्शन कर रहे हैं एक प्रयोग, एक कम विषाक्त रंग पसंद किया जा सकता है.
लोड हो रहा है जेल वैद्युतकणसंचलन में इस्तेमाल रंगों के तीन प्रमुख उद्देश्यों की सेवा. पहले वे नमूना घनत्व जोड़नेयह जेल में सिंक करने के लिए अनुमति देता है. दूसरा, रंजक, रंग प्रदान करने और प्रक्रिया को सरल लोड हो रहा है. अंत में, रंग जेल के माध्यम से मानक दरों पर ले जाते हैं, दूरी का अनुमान है कि डीएनए टुकड़े चले गए के लिए अनुमति देता है.
अलग डीएनए टुकड़े का सही आकार प्रत्येक बैंड द्वारा कूच दूरी के खिलाफ एक डीएनए मानक के विभिन्न बैंड के लिए आणविक वजन लॉग साजिश रचने के द्वारा निर्धारित किया जा सकता है. डीएनए मानक पूर्व निर्धारित आकार के डीएनए टुकड़े कि अज्ञात डीएनए नमूने के खिलाफ तुलना में किया जा सकता है की एक मिश्रण होता है. यह नोट करना महत्वपूर्ण है कि डीएनए के विभिन्न रूपों अलग दरों पर जेल के माध्यम से कदम. Supercoiled प्लास्मिड डीएनए, अपनी कॉम्पैक्ट रचना की वजह से, सबसे तेजी से जेल के माध्यम से चलता है, एक ही आकार के एक रैखिक डीएनए खुला परिपत्र धीमी यात्रा फार्म के साथ, टुकड़ा द्वारा पीछा किया.
अंत में, 1970 में agarose जैल के डीएनए की जुदाई के लिए गोद लेने के बाद से, यह हैजैविक विज्ञान अनुसंधान में सबसे उपयोगी और बहुमुखी तकनीक साबित हो.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Name of reagent | Company | Catalog number | Comments |
| Agarose I | Amresco | 0710 | |
| Boric acid | Sigma | B7901 | |
| Bromophenol blue | Sigma | B8026 | |
| EDTA | Sigma | E9884 | |
| Ethidium bromide | Sigma | E7637 | Carcinogenic-needs to be disposed of as hazardous waste |
| Glacial acetic acid | Fisher | BP2401-212 | Corrosive |
| Glycerol | Fisher | G33-1 | |
| Xylene cyanol FF | Sigma | X4126 | |
| Tris base | Sigma | T1503 | |
| Investigator/FX gel documentation system | Fotodyne | ||
| Owl Easycast B1 mini gel electrophoresis system | Thermo Scientific | B1-PTM | |
| EPS 301 power supply | GE Healthcare | 18-1130-01 |
References
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