Bioluminescens Imaging av NADPH oksidase aktivitet i ulike dyremodeller

Summary

NADPH oksidase er den viktigste kilden til reaktive oksygen arter (ROS) i fagocytter. På grunn av det flyktige natur ROS, er det vanskelig å måle og overvåke ROS nivåer i levende dyr. En minimal invasiv metode for seriell kvantifisering av ROS i levende mus er beskrevet.

Abstract

NADPH oksidase er en kritisk enzym som formidler antibakteriell og soppdrepende vert forsvar. I tillegg til sin rolle i antimikrobiell vert forsvar, har NADPH oksidase kritiske signaliserer funksjoner som modulerer betennelsesreaksjon ^en. Således er utviklingen av en fremgangsmåte for å måle i "real-time" kinetikk NADPH oksidase-avledet ROS generasjon forventet å være et verdifullt forskningsverktøy å forstå mekanismene relevante vert forsvar, inflammasjon og skade.

Kronisk granulomatøs sykdom (CGD) er en arvelig lidelse av NADPH oksidase preget av alvorlige infeksjoner og overdreven betennelse. Aktivering av phagocyte NADPH oksidase krever translokasjon av sine cytosoliske subenheter (P47 ^phox, P67 ^phox, og p40 ^phox) og Rac til en membran-bundet flavocytochrome (sammensatt av en gp91 ^phox og p22 ^phox heterodimer). Tapav funksjon mutasjoner i noen av disse NADPH oksidase komponenter resultat i CGD. I likhet med pasienter med CGD, gp91 ^{phox-mangelfull} mus og P47 ^{phox-mangelfull} mus har defekt phagocyte NADPH oksidase aktivitet og nedsatt vert ^{13 forsvar, 14.} I tillegg til fagocytter, som inneholder de NADPH oksidase komponenter beskrevet ovenfor, en rekke andre celletyper uttrykker forskjellige isoformer av NADPH oksidase.

Her beskriver vi en metode for å kvantifisere ROS produksjon i levende mus samt avgrense bidrag NADPH oksidase til ROS generasjon i modeller av betennelse og skade. Denne metoden er basert på ROS omsetning med L-012 (en analog av luminol) som sender ut luminescens som er registrert av en charge-coupled device (CCD). I den opprinnelige beskrivelsen av L-012-proben, ble L-012-avhengig kjemiluminescens helt avskaffet ved superoxide dismutase, som indikerer at de viktigste ROS påvist i denne reaksjonen var superoksid anion ^15. Senere studier har vist at L-012 kan detektere andre frie radikaler inkludert reaktive nitrogenforbindelser ^{16, 17.} Kielland mfl.. ¹⁷ viste at topisk påføring av forbol myristat acetat, en potent aktivator av NADPH oksydase, førte til NADPH oksidase-avhengig ROS generasjon som kunne påvises i mus ved hjelp av den luminescerende sonde L-012. I denne modellen, viste de at L-012-avhengige luminescence ble avskaffet i P47 ^{phox-mangelfull} mus.

Vi sammenlignet ROS generasjon i wildtype mus og NADPH oksidase-mangelfull P47 ^{phox-/ –} mus ² i følgende tre modeller: 1) intratrakeal administrasjon av zymosan, en pro-inflammatorisk soppens cellevegg-avledet produkt som kan aktivere NADPH oksidase, 2) cecal ligation og punktering (CLP), en modell av intra-abdominale sepsis med sekundær akutt lunge betennelse og skade, og 3) muntlig karbontetraklorid(CCl _4), en modell av ROS-avhengige leverskade. Disse modellene ble spesielt utvalgt for å evaluere NADPH oksidase-avhengige ROS generasjon i sammenheng med ikke-infeksiøs inflammasjon, polymikrobielle sepsis og toksin-indusert orgel skade, henholdsvis. Sammenligning Bioluminescens i wildtype mus til P47 ^{phox-/ –} mus gjør at vi kan avgrense den spesifikke bidrag ROS generert av P47 ^phox-holdig NADPH oksidase til bioluminescent signalet i disse modellene.

Bioluminesens imaging resultater som viste økt ROS nivåer i wildtype mus sammenlignet med P47 ^{phox-/ –} mus indikerte at NADPH oksidase er den viktigste kilden til ROS generasjon som svar på inflammatoriske stimuli. Denne metoden gir en minimal invasiv tilnærming for "real-time" overvåking av ROS generasjon ved betennelse in vivo.

Protocol

1. Dyremodeller Mus: Bruk P47 phox-/ – mus og alder-og sex-matchet C57BL6/DBA mus. Innhente godkjenning for eksperimenter fra Institutional Animal Care og bruk komité. Anestesi: Bruk en kontinuerlig isofluran administrasjon system for å indusere anestesi. Fordamperen systemet (VetEquip) er fylt med isofluran (2-3%). Bekrefter at mus er fullt bedøvet ved å observere respirasjon, bevegelse, og hornhinnen refleks som svar på ytre stimuli. Kirurgiske prosedyrer: Skrubb…

Discussion

"Real-time" måling av reaktive oksygenarter (ROS) i levende dyr kan oppnås ved å bruke fluorescerende og kjemiluminescerende prober. Mens fluorescerende prober lider ha svake signal-til-støy-forhold ¹² er avbildningsteknikk beskrives mer følsom for påvisning av lysemisjon etter en kjemisk reaksjon av ROS med luminol-baserte substratet L-012. Som alle bioluminescent avbildningsteknikker, er denne metoden begrenset av bølgelengde-avhengig lysabsorpsjon og scatter av organer og vev. Disse eksper…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalog number	Comments
L-012	Wako Chemicals USA, Inc.	120-04891
Zymosan	Sigma, St. Louis, MO	Z4250
carbon tetrachloride	Sigma, St. Louis, MO	289116