Unfixed, फ्रोजन ऊतकों का उपयोग करने के लिए प्राकृतिक mucin वितरण का अध्ययन
Summary
Unfixed जमे हुए ऊतक इष्टतम काटना तापमान मध्यम (अक्टूबर) में एम्बेडेड नमूनों प्राकृतिक और secreted बलगम के वितरण ग्लाइकोसिलेशन का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस दृष्टिकोण ऊतक प्रसंस्करण में कम है और प्राकृतिक प्रस्तुति glycolipids mucins, और glycan-epitopes संरक्षित है. ऊतक वर्गों प्रतिदीप्ति या वर्णजनीय पता लगाने का उपयोग immunohistochemistry द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है.
Abstract
Mucins are complex and heavily glycosylated O-linked glycoproteins, which contain more than 70% carbohydrate by weight1-3. Secreted mucins, produced by goblet cells and the gastric mucosa, provide the scaffold for a micrometers-thick mucus layer that lines the epithelia of the gut and respiratory tract3,4. In addition to mucins, mucus layers also contain antimicrobial peptides, cytokines, and immunoglobulins5-9. The mucus layer is an important part of host innate immunity, and forms the first line of defense against invading microorganisms8,10-12. As such, the mucus is subject to numerous interactions with microbes, both pathogens and symbionts, and secreted mucins form an important interface for these interactions. The study of such biological interactions usually involves histological methods for tissue collection and staining. The two most commonly used histological methods for tissue collection and preservation in the clinic and in research laboratories are: formalin fixation followed by paraffin embedding, and tissue freezing, followed by embedding in cryo-protectant media.
Paraffin-embedded tissue samples produce sections with optimal qualities for histological visualization including clarity and well-defined morphology. However, during the paraffin embedding process a number of epitopes become altered and in order to study these epitopes, tissue sections have to be further processed with one of many epitope retrieval methods13. Secreted mucins and lipids are extracted from the tissue during the paraffin-embedding clearing step, which requires prolong incubation with organic solvents (xylene or Citrisolv). Therefore this approach is sub-optimal for studies focusing on the nature and distribution of mucins and mucus in vivo.
In contrast, freezing tissues in Optimal Cutting Temperature (OCT) embedding medium avoids dehydration and clearing of the sample, and maintains the sample hydration. This allows for better preservation of the hydrated mucus layer, and thus permits the study of the numerous roles of mucins in epithelial biology. As this method requires minimal processing of the tissue, the tissue is preserved in a more natural state. Therefore frozen tissues sections do not require any additional processing prior to staining and can be readily analyzed using immunohistochemistry methods.
We demonstrate the preservation of micrometers-thick secreted mucus layer in frozen colon samples. This layer is drastically reduced when the same tissues are embedded in paraffin. We also demonstrate immunofluorescence staining of glycan epitopes presented on mucins using plant lectins. The advantage of this approach is that it does not require the use of special fixatives and allows utilizing frozen tissues that may already be preserved in the laboratory.
Protocol
Discussion
जमे हुए ऊतकों में बलगम और glycan epitopes के संरक्षण के ऊतकों कि पैराफिन में एम्बेडेड थे करने के लिए बेहतर है. हम secreted बलगम परत (1 आंकड़े और 3) और तीन glycans संरचनाओं के वितरण (3 चित्रा) आयल – एम्बेडेड ऊतकों के साथ तुलना जमे हुए ऊतकों में के संरक्षण का प्रदर्शन किया. Carnoy समाधान के रूप में विशेष fixatives, 17 (60% इथेनॉल, क्लोरोफॉर्म 30%, 10% एसिटिक एसिड) ऊतकों के नमूनों में बलगम परत का इष्टतम संरक्षण के लिए विकसित किया गया है. बेहतर, इस समाधान के ऊतकों के नमूनों है कि बलगम के अध्ययन के लिए समर्पित कर रहे हैं इकट्ठा करने के लिए इस्तेमाल किया किया जाना चाहिए और बलगम परत 16-17 की चिकनी उपस्थिति बनाए रखने के लिए दिखाया गया था. अक्टूबर में एम्बेडेड unfixed जमे हुए नमूनों में बलगम परत बीहड़ प्रकट होता है और कुछ क्षेत्रों में ऊतक से अलग हो सकता है, लेकिन समग्र परत मोटाई ऊतकों कि Carnoy समाधान और embedd के साथ तय किया गया में मनाया साथ समझौते में है16-17 आयल में एड. 16 – उदाहरण के लिए, जमे हुए मानव बृहदान्त्र ऊतक अनुभाग में बलगम परत ~ 100 (चित्रा 1) सुक्ष्ममापी, जो रिपोर्ट Carnoy's तय मानव बृहदान्त्र नमूना 55.4 ± 2.5 सुक्ष्ममापी (204.8 मीटर 7.7 रेंज) के लिए सीमा के भीतर है.
यह दशकों के लिए ज्ञात किया गया है कि इथेनॉल ~ जैविक 18 नमूनों में से 30%, और संकोचन xylene के रूप में कार्बनिक सॉल्वैंट्स, 13 ऊतकों से प्रोटीन Citrisolv और क्लोरोफॉर्म निकालने lipids, glycolipids और कुछ हद तक, कि निर्जलीकरण का परिणाम है. (10%) formalin buffered निर्धारण, निर्जलीकरण (इथेनॉल एकाग्रता में वृद्धि), और समाशोधन (Citrisolv या xylene): पैराफिन embedding के लिए ऊतक प्रसंस्करण निम्नलिखित चरण शामिल हैं. Unfixed जमे हुए ऊतक वर्गों पर इन कदमों की नकल उतार कर, हम दिखा दिया कि जमे हुए ऊतक ऊतक morphology में जिसके परिणामस्वरूप वर्गों से Citrisolv बलगम है है कि आयल – एम्बेडेड ऊतकों की है कि करने के लिए समान है निष्कर्षों (Figurई 2, सही पैनल). इसके विपरीत, बलगम परत formalin या इथेनॉल (2 चित्रा, छोड़ दिया और केंद्र पैनल) के साथ ऊष्मायन से नहीं बदल गया था. यह पता चलता है कि मानक आयल embedding प्रक्रिया के समाशोधन कदम है, बलगम परत के पतन में परिणाम जो Citrisolv / xylene में लंबे समय तक ऊष्मायन की आवश्यकता है. Formalin निर्धारण बलगम परत और जमे हुए ऊतकों वर्गों है कि formalin के साथ तय किया गया lectins glycans glycolipids, और प्रोटीन (2 आंकड़े, 3 और 6) के खिलाफ और एंटीबॉडी के साथ आसानी से सना हुआ जा सकता है नुकसान नहीं करता है. ये प्रभाव नगण्य झिल्ली बाध्य प्रोटीन और विकृति ऊतक के अध्ययन के लिए किया जा सकता है, लेकिन हो सकता है वे secreted बलगम परत के रूप में अत्यधिक हाइड्रेटेड संरचनाओं के लिए विनाशकारी कर रहे हैं. Mucins हालांकि histological अध्ययन अभी भी आयल – एम्बेडेड नमूने, जिसमें बलगम परत संरक्षण suboptimal है के साथ कर रहे हैं ज्यादातर का आयोजन किया. से की सटीक पहचान के रूप में इस तरह के बलगम परत संरचना का गहराई से विश्लेषण मेंcreted या झिल्ली बाध्य MUC ग्लाइकोप्रोटीन संयोजन विशिष्ट एंटीबॉडी और प्रोटीन अनिवार्य जरूरतों की पहचान करने के लिए मास स्पेक्ट्रोमेट्री की आवश्यकता होती है. बलगम परत का संरक्षण है, लेकिन इस तरह के अध्ययन के लिए प्रारंभिक आवश्यकता है.
कई प्रयोगशालाओं अक्टूबर में जमे हुए ऊतक के नमूने है कि अतीत में विभिन्न परियोजनाओं के लिए एकत्र किए गए थे, इन ऊतकों आसानी से कर सकते हैं के mucins, glycolipids और glycan विशेष fixatives है कि विशिष्ट बलगम संरक्षण के लिए तैयार हैं ऊतकों में जमा करने की आवश्यकता को नष्ट करने के वितरण का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया. जमे हुए ऊतकों न्यूनतम प्रोसेसिंग से गुजरना और इसलिए glycans, जो प्रकृति में हाइड्रेटेड हैं प्राकृतिक वितरण संरक्षित है. यह सूक्ष्म मेजबान बातचीत के दायरे में विशेष रूप से महत्वपूर्ण है. प्राकृतिक और secreted mucins और कई glycan संरचनाओं इन "बाधा" अणुओं सजाने के वितरण बहुतायत के ज्ञान मेजबान रक्षा, माइक्रोबियल शोषण और pathogenes को समझने में महत्वपूर्ण हो जाएगाहै.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Nicole M. Nemeth (University of Georgia) and Jeanne M. Fair (LANL) for their help in harvesting chicken tissues, and Steven A. Springer for his help during filming. The care of all birds in this study was in compliance with National Institutes of Health guidelines for the humane use of laboratory animals and all protocols were approved by the Institutional Animal Care and Use Committees at Los Alamos National Security, LLC, operator of the Los Alamos National Laboratory under Contract No. DE-AC52-06NA25396 with the U.S. Department of Energy. The care of mice in this study is in compliance with UCSD animal approved protocol. Human tissues were obtained as part of UCSD approved IRB protocol. This work was supported by grant 118645 from University of California Lab Fee President Program (P.G.) and grant NS047101 from National Institute of Neurological Disorders and Stroke (Neuroscience Microscopy Shared Facility, UC San Diego).
Materials
| Name of reagent and equipment | Company | Catalogue number |
| 2-methyl butane | Fisher Scientific | 03551-4 |
| AEC peroxidase substrate kit | Vector Labs | SK-4200 |
| Alcian Blue | Sigma-Aldrich | A3157 |
| Anti-CA 19-9 monoclonal antibody | Calbiochem | CA1003 |
| Anti-MUC5AC monoclonal antibody | Millipore | MAB2011 |
| Avidin-Biotin blocking kit | Vector Labs | SP-2001 |
| Biotinylated donkey anti-mouse antibody | Jackson Immunoresearch | 90863 |
| Biotinylated SNA | Vector Labs | B-1305 |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A4503 |
| Chitin-hydrolysate | Vector Labs | SP-0090 |
| Cryostat microtome | Leica Microsystems | Leica CM 1800 |
| Hematoxylin | Surgipath Medical Ind. | 3801570 |
| Hydrogen peroxide 30% | Fisher Scientific | H325-100 |
| Jacalin-FITC | Vector Labs | FL-1151 |
| Mayer’s Hematoxylin | Sigma-Aldrich | MHS32 |
| Melibiose | Sigma-Aldrich | M5500 |
| Nuclear Fast Red | Vector Labs | H-3403 |
| OCT compound | VWR International | 25608-930 |
| Peroxidase conjugated streptavidin | Jackson Immunoresearch | 94638 |
| Schiff reagent | Electron microscopy sciences | 26052 |
| sWGA-Rhodamine | Vector Labs | RL1022S |
| TKH2 monoclonal antibody | ATCC | HB-9654 |
| VectaMount aqueous mounting media | Vector Labs | H-5501 |
| Cytoseal 60 | Thermo Scientific | 8310-4 |
| Peel-A Way molds | Polysciences Inc. | 18646A-1 |
References
- Slayter, H. S., Wold, J. K., Midtvedt, T. Intestinal mucin of germ-free rats. Biochemical and electron-microscopic characterization. Carbohydr. Res. 222, 1-9 (1991).
- Lamblin, G. The carbohydrate diversity of human respiratory mucins: a protection of the underlying mucosa. Am. Rev. Respir. Dis. 144, S19-S24 (1991).
- Corfield, A. P., Carroll, D., Myerscough, N., Probert, C. S. Mucins in the gastrointestinal tract in health and disease. Front. Biosci. 6, D1321-D1357 (2001).
- Turner, J. R. Intestinal mucosal barrier function in health and disease. Nat. Rev. Immunol. 9, 799-809 (2009).
- Lievin-Le Moal, V., Servin, A. L. The front line of enteric host defense against unwelcome intrusion of harmful microorganisms: mucins, antimicrobial peptides, and microbiota. Clin. Microbiol. Rev. 19, 315-337 (2006).
- Kim, Y. S., Ho, S. B. Intestinal goblet cells and mucins in health and disease: recent insights and progress. Curr. Gastroenterol. Rep. 12, 319-330 (2010).
- Nochi, T., Kiyono, H. Innate immunity in the mucosal immune system. Curr. Pharm. Des. 12, 4203-4213 (2006).
- Vareille, M., Kieninger, E., Edwards, M. R., Regamey, N. The airway epithelium: soldier in the fight against respiratory viruses. Clin. Microbiol. Rev. 24, 210-229 (2011).
- McGuckin, M. A., Linden, S. K., Sutton, P., Florin, T. H. Mucin dynamics and enteric pathogens. Nat. Rev. Microbiol. 9, 265-278 (2011).
- Knowles, M. R., Boucher, R. C. Mucus clearance as a primary innate defense mechanism for mammalian airways. J. Clin. Invest. 109, 571-577 (2002).
- Johansson, M. E. The inner of the two Muc2 mucin-dependent mucus layers in colon is devoid of bacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 15064-15069 (2008).
- Hooper, L. V., Macpherson, A. J. Immune adaptations that maintain homeostasis with the intestinal microbiota. Nat. Rev. Immunol. 10, 159-169 (2010).
- Hayat, M. A., Hayat, M. A. . Microscopy, Immunohistochemistry, and Antigen Retrieval Methods: For Light and Electron Microscopy. , 53-70 (2002).
- Cohen, M., Hurtado-Ziola, N., Varki, A. ABO blood group glycans modulate sialic acid recognition on erythrocytes. Blood. 114, 3668-3676 (2009).
- Cohen, M., Varki, A. The sialome–far more than the sum of its parts. OMICS. 14, 455-464 (2010).
- Ota, H., Katsuyama, T. Alternating laminated array of two types of mucin in the human gastric surface mucous later. Histochemical J. 24, 86-92 (1992).
- Matsuo, K., Ota, H., Akamatsu, T., Sugiyama, A., Katsuyama, T. Histochemistry of the surface mucous gel layer of the human colon. Gut. 40, 782-789 (1997).
- Boyde, A., Maconnachie, E. Treatment with lithium salts reduces ethanol dehydration shrinkage of glutaraldehyde fixed tissue. Histochemistry. 66, 181-187 (1980).
