Fibroblast rimozione veloce da alta densità Culture staminali embrionali umane
Summary
Nonostante gli sforzi volti a culture di transizione a feeder liberi condizioni, la derivazione e la cultura di cellule staminali embrionali umane (hESC) rimangono in gran parte dipendente dal co-colture con alimentatori embrionali di topo (MEF). Qui vi mostriamo una nuova metodologia per la rapida rimozione di alimentatori da culture hESC prima della sperimentazione.
Abstract
Mouse fibroblasti embrionali (MEF) sono stati usati per creare cellule staminali embrionali umane (hESC) colture dopo l'isolamento blastocisti 1. Questo sistema di alimentazione mantiene hESCs dal subire differenziazione spontanea durante l'espansione delle cellule. Tuttavia, questo metodo di co-cultura è un lavoro dispendioso, richiede personale altamente qualificato, e la purezza hESC rendimenti bassi 4. Molti laboratori hanno tentato di minimizzare il numero di cellule feeder in colture hESC (cioè incorporando matrice rivestite piatti o altri tipi di cellule alimentatore 5-8). Questi sistemi di coltura modificati hanno mostrato qualche promessa, ma non hanno soppiantato il metodo standard per hESC coltura con fibroblasti di topo mitomicina C trattati con embyronic al fine di ritardare indesiderato differenziazione spontanea delle culture hESC. Pertanto, le cellule di alimentazione utilizzati in espansione hESC devono essere rimosse durante esperimenti di differenziazione. Sebbene diverse tecniche sono disponibili per purificare il co hESClonies (FACS, MACS, o l'uso di vettori resistenti ai farmaci) da alimentatori, queste tecniche sono alta intensità di manodopera, costoso e / o distruttiva per la cellule staminali embrionali umane. Lo scopo di questo progetto è stato quello di inventare un metodo di purificazione che consente la raccolta di una popolazione pura di hESC. Abbiamo osservato che in una cultura hESC confluenti, la popolazione MEF può essere rimosso con una semplice e rapida aspirazione del foglio MEF. Questa rimozione dipende da diversi fattori, tra laterale cellula-cellula legame di MEFs che hanno una bassa affinità di legame alla piastra di coltura stirene, e la capacità di colonie di cellule staminali per spingere i fibroblasti verso l'esterno durante la generazione della propria " di nicchia ". Il hESC sono stati poi esaminati per SSE-4, Oct3 / 4 e Tra 1-81 espressione fino a 10 giorni dopo la rimozione MEF per garantire il mantenimento della pluripotenza. Inoltre, le colonie hESC sono stati in grado di continuare a crescere in grandi formazioni da dopo la rimozione del MEF, che fornisce un ulteriore livello di espansione cellule staminali embrionali umane.
Protocol
Discussion
Il metodo presentato in questo manoscritto offre un'alternativa rapida e meno costosa per eliminare cellule di alimentazione fibroblasti umani da colture di cellule embrionali. Un'efficace rimozione dei fibroblasti dipende dall'esistenza di un monostrato confluente strettamente di queste cellule che si sviluppa in colture di cellule staminali più lunghi. Dopo 7-10 giorni, le colonie hESC crescenti spingerà i fibroblasti feeder in una direzione verso l'esterno, generando un monostrato di fibroblasti sem…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato finanziato da un premio II Facoltà di nuovo dal California Institute of Regenerative Medicine (RN2-00921-1), e un NIH-finanziato Premio Nazionale delle Ricerche (F32-HL104924)
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| DDR2 | Santa Cruz | 7555 | Fibroblast Marker |
| Dapi | Calbiochem | 268298 | Cell Nucleus Marker |
| SSEA-4 | Millipore | MAB4304 | Human ESC Marker |
| Oct 3/4 | Santa Cruz | 9081 | Human ESC Marker |
| Flk-1 | BD Pharma | 555307 | Early Differentiation Marker |
| Tra-1-81 | Acris | AM20377AF4-S | Human ESC Marker |
Table 1. Table of specific reagents used for immunostaining the hESC.
References
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